退行性脊柱側(cè)凸間充質(zhì)干細胞比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、退行性脊柱側(cè)凸(degenerative scoliosis,DS)隨著人口老齡化及老年人生活方式的轉(zhuǎn)變,已成為導(dǎo)致脊柱畸形、功能障礙、影響生活質(zhì)量的一種重要的腰椎退行性疾病。DS的病因尚不明確,可能與椎間盤、關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)的不對稱退變、骨質(zhì)疏松和遺傳學(xué)因素有關(guān),但均沒有明確證據(jù)可以解釋其病因。目前關(guān)于該病的研究絕大多數(shù)都是針對該病的治療,涉及病因?qū)W方面的基礎(chǔ)研究很少,而且還沒有分子生物學(xué)方面的報道。因此,弄清DS的病因及發(fā)病機制具有重要意

2、義。
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞(bone merrow-dcrived mesenchymal stem cell,BM-MSC)是成骨細胞的干/祖細胞,可以在體內(nèi)不斷分化為骨組織的各種成分,成骨相關(guān)的疾病很可能是在干細胞水平上發(fā)生了異常而產(chǎn)生疾病,因此從MSC水平對骨病成因進行研究很有必要。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)是一項新興的實驗技術(shù),能從蛋白質(zhì)的整體水平,更深入、更接近生命本質(zhì)的層次去發(fā)現(xiàn)和探討生命活動的規(guī)律及其重要生理病理

3、現(xiàn)象的本質(zhì)。而MSC的蛋白質(zhì)組學(xué)研究剛剛起步,尤其是對于疾病的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究更是少有報道。2D-DIGE是近年來發(fā)展成熟的蛋白質(zhì)組技術(shù),是目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中可信度和準(zhǔn)確性最高的技術(shù)之一。
　　 本研究旨在首先培養(yǎng)和鑒定DS患者和對照組(腰椎管狹窄患者)的MSC,然后采用蛋白質(zhì)組技術(shù)從MSC的水平尋找DS與對照組的差異蛋白,并對DS的發(fā)病機制和病因進行探討,為進一步從基因?qū)用嫜芯刻峁┮罁?jù)。
　　 研究目的:

4、>　　 1.分離和培養(yǎng)擴增DS患者和對照組的MSC,并對其進行鑒定。
　　 2.構(gòu)建DS患者與對照間MSC差異蛋白質(zhì)組圖譜。
　　 3.應(yīng)用質(zhì)譜鑒定技術(shù),對差異蛋白質(zhì)點進行鑒定。
　　 4.結(jié)合蛋白功能網(wǎng)絡(luò)研究成果,分析所鑒定的蛋白質(zhì)在DS發(fā)生發(fā)展中的作用,并為在基因?qū)用娴倪M一步研究提供依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 1.采集12例退行性脊柱側(cè)凸患者和12例年齡、性別匹配的腰椎管狹窄患者的骨髓,

5、分離、培養(yǎng)擴增MSC,制備MSC蛋白質(zhì)樣品。并采用流式細胞儀檢測細胞表面抗原,成骨誘導(dǎo)體系及脂肪誘導(dǎo)體系分別誘導(dǎo)MSC定向分化,通過細胞形態(tài)觀察及免疫化學(xué)染色進行鑒定。
　　 2.CyDye染料交叉標(biāo)記,然后進行熒光雙向差異凝膠電泳、圖像掃描,并用DeCyderv.5.02圖像分析軟件對DIGE圖像進行分析和尋找差異點。
　　 3.對篩選出的差異點進行基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析,檢

6、索IPI-HUMAN數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.從DS和腰椎管狹窄患者的骨髓液中分離出MSC。這些MSC穩(wěn)定表達CD29、CD44、CDl05,不表達CD31、CD34、CD45。定向誘導(dǎo)的成骨細胞表達堿性磷酸酶活性,脂肪細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂滴。
　　 2.經(jīng)過熒光雙向差異凝膠電泳、DeCyder軟件分析發(fā)現(xiàn),DS患者和腰椎管狹窄患者MSC中共有115個蛋白質(zhì)差異點,兩者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其

7、中有70個點在DS干細胞中上調(diào),有45個點表達下調(diào)。
　　 3.115個蛋白質(zhì)差異點經(jīng)質(zhì)譜分析,IPI-HUMAN數(shù)據(jù)庫鑒定44個差異蛋白。
　　 結(jié)論:
　　 1.應(yīng)用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法并通過流式細胞術(shù)檢測及定向誘導(dǎo)分化,能夠從DS和對照組患者的骨髓液中分離出MSC,并完成MSC表型和多向分化的初步鑒定。
　　 2.首次對DS患者進行MSC水平的蛋白質(zhì)組研究,構(gòu)建了MSC差異蛋白質(zhì)組資料庫。