丹參素對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松合并骨缺損及肌肉萎縮的影響.pdf

1、[目的]：
　　建立糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松合并骨缺損及肌肉萎縮的大鼠模型，并應(yīng)用不同劑量的丹參素對其進(jìn)行藥物干預(yù)。通過采用Micro-CT骨組織三維計(jì)量學(xué)、骨組織二維形態(tài)計(jì)量學(xué)、實(shí)驗(yàn)性生物力學(xué)、Realtime PCR等方法觀察丹參素對大鼠骨組織、肌肉組織、骨缺損愈合的影響，并分別探討其作用機(jī)理。為丹參素防治糖皮質(zhì)激素誘發(fā)骨質(zhì)疏松性骨折(GIOPF)以及糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的肌病(GIMP)的可能性與可行性提供科學(xué)依據(jù)。
　　[方法

2、]：
　　采用96只4～5月齡雌性SD大鼠，平均體重(220g±10g)，隨機(jī)分成5組。第一組為空白年齡對照組，給予正常飲食及蒸餾水5ml/kg/d灌胃。第二至五組進(jìn)行糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松造模，上午給予醋酸潑尼松龍(GC)6mg/kg/d灌胃，下午分別給予下列藥物干預(yù):蒸餾水（GC組）5ml/kg/d，丹參素(GC+T-L組)25mg/kg/d，丹參素(GC+T-H組)50mg/kg/d，羅蓋全（GC+Cal組）0.045ug/k

3、g/d，共給藥90天。分別在第30天，第60天，第90天用雙能X線檢測大鼠活體腰椎及股骨骨密度，確定糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松造模成功。
　　于第91天，對所有分組動(dòng)物均行右側(cè)脛骨近端鉆孔，于第92天行大鼠活體右側(cè)脛骨近端Micro-CT掃描，確定骨缺損造模成功。第91天起第二至第五組動(dòng)物停止應(yīng)用糖皮質(zhì)激素灌胃，改為上午繼續(xù)應(yīng)用藥物干預(yù):蒸餾水(GC組)5ml/kg/d，丹參素（GC+T-L組）25mg/kg/d，丹參素（GC+T-H組

4、）50mg/kg/d，羅蓋全（GC+Cal組）0.045ug/kg/d，共給藥6周。分別于鉆孔造模后第2周（第105天）、第4周（第119天）行大鼠活體右側(cè)脛骨近端Micro-CT掃描。
　　于骨缺損造模后第6周（第133天）實(shí)驗(yàn)結(jié)束。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前第3，4，13和14天，分別給所有大鼠皮下注射鈣黃綠素(10mg/kg)進(jìn)行熒光標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，用7％水合氯醛按0.3ml/100g行腹腔注射麻醉，右心室徹底抽血處死。分離血清，檢測

5、生化指標(biāo)（血鈣、血磷、血糖、堿性磷酸酶）;分離子宮、卵巢、腦、胸腺、腎上腺、比目魚肌、腓腸肌、趾長伸肌，觀察大體形態(tài)并稱取濕重;取左側(cè)脛骨上段、左側(cè)脛骨中段和第五腰椎進(jìn)行不脫鈣包埋后分別制成骨切片和骨磨片，通過半自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測量;取右側(cè)股骨，用858 Mini Bionix型材料測試系統(tǒng)分析大鼠右側(cè)脛骨荷孔（三點(diǎn)彎曲法）的生物力學(xué)性能;取右側(cè)脛骨，利用Micro-CT檢測骨微結(jié)構(gòu)及骨鉆孔處骨微結(jié)構(gòu);右側(cè)脛骨掃描完

6、Micro-CT后，取鉆孔處骨痂，用Real-Time PCR技術(shù)檢測細(xì)胞因子:轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、骨形態(tài)生成蛋白-2(BMP-2)的表達(dá);取右側(cè)腓腸肌，用Real-Time PCR技術(shù)，檢測肌肉組織泛素系統(tǒng)的mRNA表達(dá)。
　　[結(jié)果]：
　　1.對大鼠體重與器官、肌肉濕重的影響
　　1.1.糖皮質(zhì)激素對大鼠體重與器官、肌肉濕重影響
　　與Cont組比較，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素

7、兩周后，GC組大鼠體重下降（P＜0.05），隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，體重降低趨勢更加明顯。第90天撤去糖皮質(zhì)激素后，體重隨著時(shí)間逐漸恢復(fù)，但至實(shí)驗(yàn)終止，仍無法恢復(fù)至接近正常組體重;子宮、卵巢、腦、腎上腺、胸腺濕重均下降;比目魚肌和腓腸肌濕重均有所下降，趾長伸肌濕重下降有顯著性差別(P＜0.05)。
　　1.2.丹參素對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松大鼠體重與器官、肌肉濕重影響
　　與Cont組比較，GC+T-L組、GC+T-H組、GC+Cal組體

8、重在2周～12周均呈降低趨勢，但下降幅度不如GC組;與GC組比較，各藥物干預(yù)組自第12周撤去糖皮質(zhì)激素始至第20周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，體重恢復(fù)趨勢均比GC組高，其中GC+T-L組體重恢復(fù)幾乎接近正常組體重(P＞0.05);與GC組相比，GC+T-L組、GC+T-H組、GC+Cal組的卵巢、子宮、腎上腺、腦和胸腺濕重均不同程度增加;與GC組比較，GC+T-L組、GC+T-H組、GC+Cal組的腓腸肌濕重有增加趨勢，比目魚肌和趾長伸肌濕重增加有顯著性

9、差別(P＜0.05)。
　　2.對大鼠血清生化指標(biāo)的影響
　　與Cont組相比，GC組大鼠血清Ca2+和ALP含量降低，GLU含量顯著增加，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，P含量無明顯差異;與GC組相比，GC+T-L組、GC+T-H組、GC+Cal組血清Ca2+和ALP含量均呈增加趨勢，GLU呈下降趨勢，其中GC+Cal組Ca2+、ALP、及GLU數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.對大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)的

10、影響
　　3.1.糖皮質(zhì)激素對大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)的影響
　　靜態(tài)參數(shù):與Cont組相比，GC組大鼠脛骨上段松質(zhì)骨％Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N、均顯著減少，Tb.Sp、Oc.N、％Oc.Pm顯著增加（all P＜0.05）;脛骨中段皮質(zhì)骨Ct.Ar、％Ct.Ar呈降低趨勢，％Ma.Ar增加(all P＜0.05);腰椎松質(zhì)骨％Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N均呈降低趨勢，Tb.Sp、Oc.N、％Oc.Pm呈增加趨勢

11、。
　　動(dòng)態(tài)參數(shù):與Cont組相比，GC組大鼠脛骨上段松質(zhì)骨％L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV均顯著降低(all P＜0.05);脛骨中段皮質(zhì)骨％P-L.Pm、P-MAR、P-BFR/BS均顯著降低（all P＜0.05），％E-L.Pm顯著增加(P＜0.05);腰椎松質(zhì)骨％P-L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV均顯著降低(all P＜0.05)。
　　3.2.丹參素對糖皮質(zhì)

12、激素性骨質(zhì)疏松大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)的影響
　　靜態(tài)參數(shù):與GC組相比，各給藥組大鼠脛骨上段松質(zhì)骨％Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N均呈增加趨勢，Tb.Sp、Oc.N、％Oc.Pm均呈降低趨勢，其中GC+T-L組和GC+Cal組數(shù)據(jù)有顯著性差別（P＜0.05）;各給藥組大鼠脛骨中段Ct.Ar、％Ct.Ar均增加趨勢，％Ma.Ar均呈降低趨勢，數(shù)據(jù)均有顯著性差別(allP＜0.05);腰椎松質(zhì)骨GC+T-L組和GC+Cal組％Tb

13、.Ar、Tb.Th均顯著增加，Tb.Sp顯著降低(all P＜0.05)，Tb.N呈增加趨勢(P＞0.05)。GC+T-H組％Tb.Ar、Tb.N、Tb.Th均呈增加趨勢，Tb.Sp呈降低趨勢(P＞0.05)。各給藥組Oc.N、％Oc.Pm均呈降低趨勢(all P＜0.05)。
　　動(dòng)態(tài)參數(shù):與GC組相比，各給藥組大鼠脛骨上段松質(zhì)骨％L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV均呈增加趨勢，其中GC+T-L組和GC+

14、Cal組數(shù)據(jù)有顯著性差別(P＜0.05); GC+T-L組和GC+Cal組大鼠脛骨中段％E-L.Pm顯著降低（P＜0.05），％P-L.Pm、P-MAR、P-BFR/BS顯著增加(P＜0.05)，GC+T-H組各指標(biāo)變化趨勢與上述一致，但數(shù)據(jù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各給藥組腰椎松質(zhì)骨％P-L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV均呈增加趨向。
　　4.對脛骨骨缺損部位及骨痂Micro-CT三維形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果的影響
　

15、　脛骨骨缺損部位:與GC組比較，骨缺損后第2周，GC+T-L組和GC+Cal組孔洞內(nèi)骨痂量明顯增多，GC+Cal組骨痂大部分填充，GC+T-H組無明顯差異;第4周，GC+T-L組和GC+Cal組外觀均已不見明顯孔洞，骨痂已基本填充，GC+T-H組仍可見孔洞大體形狀，骨痂填充較GC組少;第6周，各組孔洞已不可見，骨缺損處已基本愈合。
　　骨痂:大體形態(tài):隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，各組骨缺損處骨痂均有不同程度的增多。GC+T-L組、GC+Cal組

16、骨痂大體形態(tài)與GC組比較，隨著時(shí)間推移，其體積逐步增大、骨痂中孔隙逐步減少、趨向飽滿，兩組作用效果相近并優(yōu)于Cont組骨痂形態(tài);骨痂骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo):與Cont比較，撤出GC后，GC組骨架的BV/TV第2周仍呈下降趨勢，但第4、6周逐漸增加，回復(fù)致正常，Tb.N、Conn-D隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展呈增加趨勢，Tb.Sp呈降低趨勢;與GC組比較，GC+T-L組BV/TV、Tb.N、Conn-D隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)展呈逐步增加趨勢，Tb.Sp、SMI呈逐步降低趨勢，

17、該組趨勢與GC+Cal組趨勢類似并優(yōu)于Cont組;GC+T-H組BV/TV、Tb.N、Con-D與GC組比較呈逐步降低趨勢、Tb.Sp、SMI呈逐步升高趨勢。
　　5.對荷孔脛骨生物力學(xué)參數(shù)的影響
　　與Cont組相比，GC組大鼠荷孔脛骨生物力學(xué)性能最大載荷、斷裂載荷、彈性載荷、剛度均呈降低趨勢（P＜0.05）。與GC組比較，GC+T-L組、GC+T-H組、GC+Cal組最大載荷、斷裂載荷、彈性載荷、剛度均呈增加趨勢，并具有

18、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.對骨密度(BMD)和骨礦鹽含量(BMC)的影響
　　在糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松造模階段，隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，與Cont組比較，各藥物干預(yù)組大鼠股骨骨密度均呈不同程度的下降。造模結(jié)束時(shí)（第90天），GC組骨密度數(shù)值降低有顯著性差別(P＜0.05)，提示造模成功。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后（第133天），分離大鼠股骨檢測。與Cont組相比，GC組大鼠股骨的BMD和BMC均呈下降趨勢，數(shù)值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

19、0.05)。與GC組相比，GC+T-L組、GC+T-H組、GC+Cal組大鼠股骨BMD和BMC均呈增加趨勢。
　　7.對骨痂細(xì)胞因子及肌肉組織泛素mRNA表達(dá)的影響
　　7.1.對骨痂細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響
　　與Cont組相比，各給藥組的BMP-2、VEGF和TGF-β均呈增加趨勢;與GC組比較，GC+Cal組BMP-2、VEGF和TGF-β表達(dá)呈增加趨勢。GC+T-L組 VEGF和TGF-β表達(dá)顯著增加（P＜0

20、.05），BMP-2表達(dá)呈增加趨勢。GC+T-H組BMP-2和VEGF表達(dá)呈增加趨勢，TGF-β表達(dá)減少。
　　7.2.對肌肉組織泛素mRNA表達(dá)的影響
　　與Cont組相比，GC組大鼠肌肉組織泛素化系統(tǒng)mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05）;與GC組比較，GC+T-L組、GC+T-H組、GC+Cal組表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。
　　[結(jié)論]：
　　1.醋酸潑尼松龍6mg/kg/d灌胃90天后，可導(dǎo)致大鼠體重、

21、骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量顯著下降。對大鼠行骨缺損干預(yù)并停用激素后，仍可導(dǎo)致缺損部位骨量形成降低，但6周時(shí)基本回復(fù)正常。撤除潑尼松后6周，大鼠體重和免疫器官重量、骨密度和骨小梁數(shù)量仍降低，伴隨腓腸肌、比目魚肌和趾長伸肌濕重下降，大鼠肌肉組織泛素化系統(tǒng)mRNA表達(dá)顯著增加。結(jié)果說明糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致大鼠骨質(zhì)疏松合并肌肉萎縮，撤藥后可短暫延緩骨缺損愈合。
　　2.丹參素25mg/kg/d可以有效抑制糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的大鼠的骨