miR-146a抑制PBMC源性破骨細(xì)胞形成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性關(guān)節(jié)炎癥為特點(diǎn)的全身性自身免疫病，其主要臨床表現(xiàn)是關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞、關(guān)節(jié)腫脹和關(guān)節(jié)功能障礙。其中，破骨細(xì)胞被證明在RA的關(guān)節(jié)損害中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。骨質(zhì)疏松(osteoporosis)是一種多病因的、以單位體積內(nèi)骨組織量減少為特點(diǎn)的代謝性骨病，往往存在著OC的骨吸收活性與成骨細(xì)胞的骨形成活性之間的失衡。因此，這兩種疾病都存在著過強(qiáng)的破骨細(xì)胞活性。理論上，以破骨

2、細(xì)胞作為靶點(diǎn)的治療策略，有望為RA或骨質(zhì)疏松患者帶來重大意義。
　　MiR-146a與免疫反應(yīng)關(guān)系密切。MiR-146a的兩個(gè)靶蛋白:表皮生長因子受體(EGFR)和TNF受體相關(guān)因子-6(TRAF6)在破骨細(xì)胞的形成過程中具有重要作用。使用穩(wěn)定性高的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，使細(xì)胞內(nèi)miR-146a過表達(dá)，通過下調(diào)EGFR和TRAF6的水平，實(shí)現(xiàn)對(duì)破骨細(xì)胞形成相關(guān)的信號(hào)通路的微調(diào)控，對(duì)于RA或骨質(zhì)疏松的治療有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　在本研究中

3、，我們使用人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)作為破骨細(xì)胞前體，通過核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-kB l igand，RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)兩種細(xì)胞因子的刺激促使其向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化;利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)異丙基-β-D硫代半乳

4、糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導(dǎo)，獲得基于MS2噬菌體的裝載miR-146a的重組病毒樣顆粒(MS2-miR-146a VLPs);與Tat47-57進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)后，VLPs獲得自主穿透細(xì)胞膜的能力。用不同劑量的MS2-miR-146a VLPs處理PBMCs后，伴隨著細(xì)胞內(nèi)miR-146a的升高，Western Blot檢測到miR-146a的兩個(gè)靶蛋白EGFR和TRAF6的表達(dá)水平下降;

5、實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄定量PCR提示破骨細(xì)胞的四個(gè)標(biāo)志基因:TRAP，PU.1CATK，CA2的表達(dá)水平明顯下調(diào);通過抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acidphatase，TRAP)染色，發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞的形成數(shù)量明顯減少;通過與骨片共培養(yǎng)并對(duì)骨片上的吸收陷窩進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞的活性明顯受抑。可見細(xì)胞內(nèi)升高的miR-146a發(fā)揮了對(duì)破骨細(xì)胞形成和活性的抑制作用。
　　這種基于MS2噬菌體病毒樣顆粒的遞送