miR-155對MST2的靶向抑制在血管重塑中的作用及機制.pdf

1、哺乳動物Ste20樣激酶2（mammalian sterile20-like kinase2，MST2）作為Hippo通路的核心組件，在調(diào)節(jié)細胞增殖、生長和細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用小鼠股動脈損傷誘導的血管內(nèi)膜增生模型，探討MST2在miR-155介導的炎癥和氧化應(yīng)激發(fā)生發(fā)展中的作用，旨在為闡明miR-155在血管重塑中的作用機制以及藥物開發(fā)研究提供實驗基礎(chǔ)。本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 miR-155

2、促進血管平滑肌細胞增殖和血管內(nèi)膜增生
　　目的:探討miR-155對血管平滑肌細胞增殖和凋亡的影響及其在新生內(nèi)膜形成中的作用。
　　方法:1.過表達或敲低血管平滑肌細胞中的miR-155，Western blot檢測增殖標志基因，細胞計數(shù)、MTS測定細胞增殖。2.對miR-155基因敲除(miR-155-/-)小鼠和野生型(WT)小鼠進行右則股動脈導絲損傷。蘇木精-伊紅染色（HE）觀察和評價內(nèi)膜增生的形態(tài)學改變。3.實時定量

3、PCR(qRT-PCR)檢測WT及miR-155-/-鼠股動脈損傷前后miR-155的表達。4.野生型小鼠股動脈損傷后原位過表達miR-155、原位轉(zhuǎn)染miR-155激動劑及抑制劑，HE染色驗證內(nèi)膜增生的形態(tài)學改變。5.SM22α聯(lián)合MAC2免疫雙熒光染色觀察平滑肌細胞增殖和巨噬細胞浸潤。6.SM22α聯(lián)合miR-155熒光探針原位雜交定位miR-155的表達。7.TUNEL染色和Westernblot檢測過表達miR-155對血管平滑

4、肌細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.過表達和敲低miR-155分別促進或抑制體外培養(yǎng)的血管平滑肌細胞增殖。
　　2.miR-155遺傳性缺失顯著抑制導絲損傷所誘導的血管內(nèi)膜增生。
　　3.原位過表達miR-155促進導絲損傷所誘導的血管內(nèi)膜增生。
　　4.原位轉(zhuǎn)染miR-155激動劑促進、轉(zhuǎn)染抑制劑減少導絲損傷所誘導的血管內(nèi)膜增生。
　　5.在損傷的血管中miR-155主要來源于平滑肌細胞。

5、>　　6.過表達miR-155抑制H2O2誘導的血管平滑肌凋亡。
　　小結(jié):
　　miR-155促進體外培養(yǎng)的血管平滑肌細胞增殖和抑制由H2O2誘導的細胞凋亡;遺傳敲除miR-155顯著降低導絲損傷誘導的血管內(nèi)膜增生;miR-155功能獲得或缺失實驗均證實miR-155在血管平滑肌細胞增殖和新生內(nèi)膜形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。
　　第二部分 miR-155通過靶向抑制MST2促進炎癥和氧化應(yīng)激，導致血管平滑肌細胞增殖和重

6、塑
　　目的:揭示miR-155通過靶向抑制MST2進而促進炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)及導致血管平滑肌細胞增殖和血管重塑的作用機制。
　　方法:1.通過miRanda和RNAhybrid兩網(wǎng)站對細胞增殖和遷移相關(guān)基因進行預(yù)測。2.合成靶基因3'非編碼序列(UTR)及其突變體并連接到pmir-GLO雙熒光報告質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)染293A細胞并進行雙熒光報告基因活性檢測。3.血管平滑肌細胞中過表達或敲低miR-155，Western blot檢

7、測MST2和TRIM39的表達。4.對WT和miR-155-/-小鼠股動脈導絲損傷組織進行MST2和SM22α免疫雙熒光染色。5.qRT-PCR檢測損傷組織中炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達。6.在血管平滑肌細胞中過表達miR-155的同時過表達MST2，檢測MST2介導miR-155對血管平滑肌細胞增殖的影響。
　　結(jié)果:
　　1.在血管平滑肌細胞中MST2是miR-155的直接靶基因。
　　2.miR-155靶向抑制M

8、ST2促進血管平滑肌細胞的增殖與遷移。
　　3.miR-155靶向抑制MST2促進NF-κB、TNF-α、p47phox和HO-1表達。
　　小結(jié):
　　miR-155通過靶向抑制MST2促進炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達，進而導致血管平滑肌細胞的增殖、遷移和血管重塑。
　　第三部分 miR-155通過靶向抑制MST2進而激活Raf-1-MEK-ERK1/2信號途徑及整合炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)
　　目的:探索miR

9、-155通過靶向抑制MST2從而調(diào)節(jié)炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達及平滑肌細胞增殖的信號傳導途徑。
　　方法:1.分別在血管平滑肌細胞中過表達或敲低miR-155，Westernblot檢測與細胞增殖相關(guān)的信號通路及炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達。2.用siRNA敲低內(nèi)源性MST2，檢測細胞增殖相關(guān)的信號通路、炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達。3.過表達miR-155的同時敲低MST2，或抑制miR-155的同時敲低MST2，Western b

10、lot檢測與細胞增殖相關(guān)的信號通路、炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達。4.敲低內(nèi)源性MST2后，分別用不同信號通路特異性抑制劑處理細胞，Western blot檢測與細胞增殖相關(guān)的信號通路、炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達。5.在血管平滑肌細胞中分別過表達或敲低miR-155后，免疫共沉淀檢測MST2、MEK、Raf-1相互作用。6.報告基因檢測NF-κB對miR-155啟動子活性的影響。7.qRT-PCR檢測損傷血管組織中PDGF mRNA的表達

11、水平。
　　結(jié)果:
　　1.miR-155通過靶向抑制MST2而活化細胞增殖相關(guān)信號途徑ERK1/2
　　在血管平滑肌細胞中分別過表達或敲低miR-155，Western blot檢測與細胞增殖相關(guān)的信號通路。結(jié)果顯示，過表達miR-155顯著下調(diào)MST2表達并增加PI3K/Akt和ERK1/2的磷酸化，但不影響JNK和p38的磷酸化。相反，與轉(zhuǎn)染對照miRNA相比，血管平滑肌細胞轉(zhuǎn)染anti-miR-155后，ERK

12、1/2的磷酸化水平顯著下降;然而，PI3K/Akt、JNK和p38的磷酸化水平?jīng)]有明顯的改變。Western blot結(jié)果顯示，在同時敲低MST2和miR-155的細胞中，ERK1/2的磷酸化水平升高，PI3K/Akt的磷酸化水平?jīng)]影響， PCNA蛋白水平增加。與單純過表達miR-155相比，當在血管平滑肌細胞中過表達miR-155的同時敲低MST2時， ERK1/2的磷酸化水平進一步增加。這些結(jié)果表明，miR-155通過靶向抑制MST

13、2而活化ERK1/2信號途徑，進而促進血管平滑肌細胞的增殖。
　　2.miR-155通過靶向抑制MST2表達整合炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)
　　Western blot結(jié)果顯示，在血管平滑肌細胞中過表達miR-155可促進p47phox和NF-κB表達;與此相反，敲低miR-155下調(diào)這些蛋白質(zhì)的表達。單純敲低MST2使p47phox和NF-κB總蛋白及其磷酸化水平升高，但同時敲低MST2和miR-155時，則下調(diào)這些蛋白質(zhì)的水平。

14、相反，單純過表達MST2使p47phox和NF-κB總蛋白及其磷酸化水平降低，但過表達MST2的同時也過表達miR-155時，又恢復了這些蛋白質(zhì)的表達水平。這些結(jié)果表明，miR-155通過MST2來調(diào)節(jié)p47phox和NF-κB的表達，MST2將炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)整合在一起。
　　3.MST2通過Raf-1-MEK-ERK1/2信號通路促進miR-155介導的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　在血管平滑肌細胞中過表達miR-155后

15、進行免疫共沉淀分析的結(jié)果表明，與對照組相比，過表達miR-155顯著增加Raf-1免疫沉淀復合物中MEK水平，降低MST2水平。相反， miR-155拮抗劑增加Raf-免疫沉淀復合物中的MST2，減少MEK。miR-155的過表達促進MEK和ERK/2磷酸化，而miR-155拮抗劑抑制這兩種信號轉(zhuǎn)導分子的磷酸化。
　　4.miR-155、NF-κB和PDGF之間形成正反饋環(huán)路
　　報告基因分析結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達N

16、F-κB顯著增加miR-155/BIC啟動子的活性。同時，在血管平滑肌細胞中過表達NF-κB后，也顯著增加miR-155基因的表達。對損傷的血管進行PDGF基因表達檢測時發(fā)現(xiàn)，miR-155-/-小鼠PDGF基因的表達水平顯著低于野生型小鼠，與原位轉(zhuǎn)染Ad-GFP組相比，原位過表達miR-155能顯著增加PDGF基因的表達水平。
　　小結(jié):
　　miR-155靶向抑制MST2，減少MST2與Raf-1的相互作用，使Raf-1

17、與MEK結(jié)合增加，進而激活ERK1/2信號通路，并整合炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　1.miR-155促進血管平滑肌細胞增殖和抑制細胞凋亡。
　　2.miR-155在血管平滑肌細胞增殖和新生內(nèi)膜形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。
　　3.在血管平滑肌細胞中MST2是miR-155的直接靶基因。
　　4.miR-155通過靶向抑制MST2促進炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達，進而導致血管平滑肌細胞的增殖、遷移和血管