蒙古綿羊皮膚毛囊細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞有機(jī)體調(diào)節(jié)發(fā)育的一個重要特征，是指細(xì)胞在內(nèi)、外因子的嚴(yán)格控制下，一種有步驟、有活性的生理性自行消亡的過程。毛囊是一個解剖結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的器官，其最顯著的特點(diǎn)為周期性再生。在哺乳動物的一生中，毛囊反復(fù)周期性地經(jīng)歷生長期、退行期和休止期的過程。Seiberg等人在前人工作的基礎(chǔ)上，結(jié)合自己的研究結(jié)果，提出毛發(fā)周期與細(xì)胞凋亡有關(guān)，認(rèn)為生長期、靜止期和退化期三個階段均伴有細(xì)胞凋亡。 本研究利用H·E染色、DNA原位末段標(biāo)記

2、、透射電子顯微鏡、免疫組織化學(xué)法和熒光實(shí)時定量PCR技術(shù)，對不同季節(jié)綿羊皮膚組織結(jié)構(gòu)、表皮層真皮層厚度、凋亡細(xì)胞分布、Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)，以及Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)的變化規(guī)律進(jìn)行了研究，以期進(jìn)一步了解毛囊生長周期與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，季節(jié)變化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，以及毛囊中細(xì)胞凋亡的規(guī)律。研究結(jié)果如下: 1.不同季節(jié)中蒙古綿羊皮膚毛囊形態(tài)的變化 (1)首先，通過常規(guī)H·E染色觀察發(fā)現(xiàn)，蒙古綿羊的皮膚結(jié)構(gòu)在各季節(jié)

3、基本一致，只是皮膚厚度隨季節(jié)變化而改變。6批樣品中，6月份樣品的表皮層是一年中最薄的，12月份樣品最厚；8月份樣品的真皮層是一年中最薄的，10月份樣品最厚。通過對各批樣品H·E切片表皮層及真皮層厚度平均值的分析發(fā)現(xiàn)，蒙古綿羊的皮膚表皮層厚度變化是連續(xù)的，而且與季節(jié)周期有密切關(guān)系。真皮層厚度對季節(jié)變化的影響比較敏感。 (2)然后，通過原位末端標(biāo)記TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，蒙古綿羊皮膚中的凋亡細(xì)胞主要存在于毛囊中，毛囊細(xì)胞的凋亡在毛囊生長

4、的各個時期都存在，凋亡細(xì)胞的數(shù)量和凋亡程度因季節(jié)而變化。蒙古綿羊皮膚的凋亡指數(shù)最高的在6月份，最低的在10月份，呈現(xiàn)一種先升高再降低又升高的倒S型變化趨勢。表皮的厚度則與凋亡細(xì)胞數(shù)呈相反關(guān)系，4月份起開始變薄，5～6月份為最薄。這種變化規(guī)律與家畜毛被季節(jié)性脫換時間相吻合。 (3)最后，利用透射電子顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，蒙古綿羊皮膚表皮顆粒層中，細(xì)胞凋亡并不常見，不同季節(jié)中，其超微結(jié)構(gòu)無明顯差異。 2.不同季節(jié)中蒙古綿羊皮膚毛囊

5、凋亡Bcl-2/Bax蛋白的變化 (1)首先，通過免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，綿羊皮膚組織Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞率在12月份最高，6月份最低；隨著月份的延伸，Bcl-2陽性細(xì)胞率數(shù)呈現(xiàn)先下降后上升的V型曲線特點(diǎn)。 (2)然后，免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，綿羊皮膚組織Bax表達(dá)陽性細(xì)胞率隨著月份的更替呈現(xiàn)先增加，在6月份達(dá)到最高后又逐漸減少的鐘形曲線。Bax表達(dá)高峰與Bcl-2表達(dá)低谷同時出現(xiàn)在6月份，說明凋亡高峰可能出現(xiàn)在這一時

6、期。 (3)最后，綿羊皮膚組織表達(dá)陽性細(xì)胞率Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值隨著月份的延伸，呈現(xiàn)先陡降后緩慢上升的V型曲線特點(diǎn)，4月份最高，6月份最低——凋亡高峰也出現(xiàn)在這一時期。這說明在皮膚的衰退期、生長期和靜止期，Bcl-2和Bax的表達(dá)呈反比關(guān)系，是一對正負(fù)凋亡調(diào)節(jié)基因。前者具有抑制細(xì)胞凋亡、延長細(xì)胞生存周期、使細(xì)胞的積累率增加的功能:后者不僅本身能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且可以與前者一起調(diào)控細(xì)胞凋亡。 3.不同季節(jié)中蒙古

7、綿羊皮膚毛囊Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)的變化 (1)首先，通過實(shí)時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 mRNA表達(dá)在整個毛囊生長過程中，與免疫組化實(shí)驗(yàn)中Bcl-2蛋白表達(dá)基本一致，同時與末端標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中凋亡細(xì)胞在6-8月份增加，10-12月份減少的規(guī)律也基本一致。說明Bcl-2 mRN的表達(dá)對Bcl-2蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡具有顯著作用。 (2)然后，實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明，整個毛囊生長周期中，Bax基因表達(dá)呈波浪狀的動

8、態(tài)平衡，與免疫組化實(shí)驗(yàn)中Bax蛋白的表達(dá)基本沒有相關(guān)性,這表明Bax基因mRNA表達(dá)和蛋白水平并不同步。 (3)最后，通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，Bax蛋白的表達(dá)與Bcl-2蛋白的表達(dá)呈反比關(guān)系，這說明細(xì)胞凋亡的調(diào)控主要通過Bcl-2基因來完成，Bax基因則通過對Bcl-2基因的調(diào)節(jié)，間接調(diào)控細(xì)胞的凋亡過程。Bcl-2與Bax之間相互制約、相互影響，從而保持一個相對穩(wěn)定調(diào)控。 本研究通過H·E染色、原位末端標(biāo)記、電鏡觀察、

9、免疫組織化學(xué)，以及實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)等多種檢測手段，得到了相一致的結(jié)果。研究結(jié)果充分表明:細(xì)胞凋亡與Bcl-2和Bax的表達(dá)有關(guān)，Bax基因表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2和Bax的表達(dá)在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。這為進(jìn)一步深入研究bcl-2/baX基因在細(xì)胞凋亡過程中的可能作用及調(diào)控機(jī)理，打下了理論基礎(chǔ)。對于研究家畜絨毛整個周期中毛囊細(xì)胞凋亡與絨毛生長、脫落的關(guān)系，Bcl-2/Bax表達(dá)和毛囊細(xì)胞凋亡的聯(lián)系，以及揭示羊絨毛生