骨髓源性肝干細(xì)胞的篩選、擴(kuò)增及誘導(dǎo)分化的研究肝癌術(shù)后肝再生狀態(tài)與肝癌復(fù)發(fā)關(guān)系的初步研究.pdf

1、本文共分兩部分：第一部分，骨髓源性肝干細(xì)胞的篩選、擴(kuò)增及誘導(dǎo)分化的研究摘要肝炎、肝硬化及肝癌等肝臟疾病所致的終末性肝功能障礙，目前最有效的治療手段是原位肝移植(OLT)。然而，由于供體匱乏、免疫排斥和高額費(fèi)用等問題，原位肝移植的廣泛應(yīng)用受到了限制。肝細(xì)胞移植(HTx)和生物人工肝技術(shù)(BAL)是目前建立的替代治療方式。與OLT相比，HTx和BAL具有操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)進(jìn)行、供肝細(xì)胞免疫源性較低且可凍存、移植失敗或產(chǎn)生免疫排斥對(duì)受體影響小、

2、治療費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。理論上來講，HTx和BAL在許多方面已經(jīng)具有代替原位肝移植的潛在優(yōu)勢(shì)，但事實(shí)上，HTx和BAL的臨床應(yīng)用遠(yuǎn)未達(dá)到理論上的預(yù)期效果，存在一些亟待解決的問題，其中肝細(xì)胞來源缺乏是制約這兩種治療方式發(fā)展的重要因素。目前的研究方向有永生化肝細(xì)胞和肝干細(xì)胞。由于永生化肝細(xì)胞是由病毒致癌原轉(zhuǎn)染而來，對(duì)機(jī)體有許多不確定的影響，目前尚未能對(duì)其應(yīng)用進(jìn)行評(píng)估。而干細(xì)胞由于具有自我更新、高度增殖和多向分化的潛能，為肝細(xì)胞移植及生物人工肝技術(shù)

3、展示出誘人的前景。 肝干細(xì)胞的供源研究有肝源性的的肝干細(xì)胞(LSC)或肝祖細(xì)胞(HPC)以及非肝源性肝干細(xì)胞，前者包括卵圓細(xì)胞和小肝細(xì)胞，后者包括胚胎干細(xì)胞(ESC)、胰源性肝干細(xì)胞(PDLSC)和骨髓源性肝干細(xì)胞(BDLSC)。這些干細(xì)胞源，均已證實(shí)具有向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化的潛能，但各有其優(yōu)缺點(diǎn)。從細(xì)胞特征、供體來源以及分離培養(yǎng)的特點(diǎn)等方面看，BDLSC具有易于調(diào)控、供源豐富、容易獲得、可從自體獲取、避免免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)，是較為理想

4、的肝干細(xì)胞來源。 BDLSC的研究，目前只是證實(shí)了它的存在以及轉(zhuǎn)化能力，還不能進(jìn)入應(yīng)用研究階段，原因之一在于骨髓內(nèi)的細(xì)胞群體非常復(fù)雜，至今尚未發(fā)現(xiàn)可直接鑒定BDLSC的特征性表面標(biāo)志，其在骨髓干細(xì)胞衍生過程中的具體譜系定位也不清楚，以至對(duì)其的分離純化存在困難。目前鑒別BDLSC的研究方法，需要分析新的原始細(xì)胞標(biāo)志或者新的干細(xì)胞群體，盡管有利于對(duì)骨髓內(nèi)細(xì)胞群體的精確劃分，卻導(dǎo)致了對(duì)肝干細(xì)胞識(shí)別和分離的困難，而且實(shí)用性不強(qiáng)。

5、 鑒于成體干細(xì)胞的增殖需要環(huán)境刺激的特征，肝干細(xì)胞的增殖需要肝再生的微環(huán)境，而我們的前期工作發(fā)現(xiàn)適合肝干細(xì)胞增殖的肝損傷病理微環(huán)境是其它骨髓細(xì)胞類型所不能適應(yīng)的，由此本課題設(shè)想采用適者生存的原理，建立一套病理微環(huán)境的體外篩選培養(yǎng)體系，在這一培養(yǎng)體系中，只有適應(yīng)這一環(huán)境的肝干細(xì)胞可以生存增殖，而其它類型的細(xì)胞則逐漸凋亡，從而達(dá)到從骨髓細(xì)胞的體外培養(yǎng)中直接篩選和擴(kuò)增肝干細(xì)胞的目的，并進(jìn)行體內(nèi)外誘導(dǎo)分化，探討臨床應(yīng)用的可行性。 結(jié)論：

6、1.大鼠篩選培養(yǎng)液以含5％淤膽血清的最佳，一方面可以使適應(yīng)該病理微環(huán)境的BDLSC能夠生長(zhǎng)分化，另一方面使不能適應(yīng)的非肝干細(xì)胞凋亡，達(dá)到篩選與純化的目的。擴(kuò)增培養(yǎng)體系可以將純化的肝干細(xì)胞培養(yǎng)傳代至8代，8代以后細(xì)胞出現(xiàn)纖維樣細(xì)胞的增生。流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝干細(xì)胞表面標(biāo)志，各代細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)各干細(xì)胞標(biāo)志，說明傳代的穩(wěn)定性。分化的細(xì)胞具有肝細(xì)胞樣表型和功能：表達(dá)白蛋白、AFP、CK8/18；有肝細(xì)胞特征蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄；呈現(xiàn)與肝細(xì)胞相似的超微結(jié)

7、構(gòu)；具有糖原和尿素合成的功能；經(jīng)門靜脈及經(jīng)脾移植均可整合入肝板，脾臟內(nèi)也可見肝細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖。 2.人骨髓肝干細(xì)胞的篩選采用急性肝功能不全的血清，TBIL在150μmol/L～300μmol/L，HGF濃度在10～20ng/ml，以5％濃度加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液篩選效果最為理想。擴(kuò)增培養(yǎng)液可將肝干細(xì)胞傳代達(dá)5代。流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝干細(xì)胞的表面標(biāo)志與肝卵圓細(xì)胞的標(biāo)志相似。分化細(xì)胞具有肝細(xì)胞樣的表型和功能：免疫熒光表達(dá)白蛋白；有肝細(xì)胞特征性

8、蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄；Westernblot檢測(cè)分化前后白蛋白、AFP表達(dá)有差異，分化前白蛋白低表達(dá)、AFP高表達(dá)，分化后則相反；分化細(xì)胞具有尿素及白蛋白合成功能。 [結(jié)論]1.含淤膽血清的病理篩選培養(yǎng)體系可以篩選、純化大鼠骨髓肝干細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)體系可將大鼠肝干細(xì)胞培養(yǎng)傳代達(dá)8代，分化培養(yǎng)體系可以誘導(dǎo)肝干細(xì)胞分化成具有肝細(xì)胞樣表型及功能的肝細(xì)胞樣細(xì)胞，經(jīng)門靜脈及脾臟均可進(jìn)行細(xì)胞移植，脾內(nèi)環(huán)境也適合移植細(xì)胞的生長(zhǎng)。 2.采用

9、人急性肝功能不全的病理血清可以篩選、純化人骨髓肝干細(xì)胞，獲得純化的肝干細(xì)胞后進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)目前可獲得肝干細(xì)胞傳代5代，具有與肝卵圓細(xì)胞相似的細(xì)胞表面標(biāo)志，誘導(dǎo)分化后具有肝細(xì)胞樣的表型特征及功能。 第二部分，肝癌術(shù)后肝再生狀態(tài)與肝癌復(fù)發(fā)關(guān)系的初步研究摘要原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，由于多數(shù)合并肝硬化并且難于早期診斷，預(yù)后極差。肝癌的治療，目前最有效的方法是手術(shù)治療，然而術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍嚴(yán)重影響患者的生存率。近年

10、來，對(duì)肝癌復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素進(jìn)行了廣泛的研究，腫瘤的生物學(xué)特性是目前研究的重點(diǎn)。腫瘤生物學(xué)特性也是多方面的，包括腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤包膜完整性、門靜脈癌栓、腫瘤的分化程度、p53基因突變、癌周組織的雄激素受體以及癌細(xì)胞DNA倍體情況等多個(gè)因素，至今尚缺乏判斷肝癌術(shù)后預(yù)后有效的指標(biāo)。 我們注意到，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)取決于腫瘤細(xì)胞本身的特性及腫瘤細(xì)胞所處的環(huán)境。肝切除后肝臟即進(jìn)入增殖狀態(tài)，引起一系列肝再生因子水平的變化，這些因子一方面使

11、肝再生精確、有序地進(jìn)行，另一方面也有可能影響腫瘤細(xì)胞所處的環(huán)境，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。其中，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子是肝細(xì)胞最強(qiáng)烈的增殖刺激因子和促有絲分裂原，與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。 結(jié)論：1.肝切除后，患者血清HGF水平升高，術(shù)后10天左右出現(xiàn)高峰期，14天HGF水平開始降低。大肝癌患者的升高水平明顯高于小肝癌患者，而TAE患者術(shù)后略為增高，手術(shù)患者的HGF水平與TAE患者相比各時(shí)段均有顯著意義(p＜0.05) 2.R

12、T-PCR結(jié)果顯示，術(shù)后不同復(fù)發(fā)時(shí)段肝癌組織均存在c-metmRNA的轉(zhuǎn)錄，且半定量結(jié)果顯示均比癌旁組織高，復(fù)發(fā)時(shí)間越短，轉(zhuǎn)錄水平越高；WesternBlot結(jié)果從蛋白水平證明復(fù)發(fā)時(shí)間早的患者其c-met蛋白的表達(dá)水平高，與病理結(jié)果相比較，復(fù)發(fā)時(shí)間早的患者病理惡性程度高。 3.根據(jù)以上結(jié)果，肝癌細(xì)胞表達(dá)c-met蛋白的水平可能反映腫瘤的惡性程度，與術(shù)后復(fù)發(fā)有一定的關(guān)系，從而可評(píng)估手術(shù)的預(yù)后；針對(duì)術(shù)后肝再生期對(duì)肝癌患者進(jìn)行抑制腫瘤