骨髓源肝血竇內(nèi)皮祖細(xì)胞在大鼠ALPPS術(shù)后肝再生中的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分：大鼠ALPPS手術(shù)模型的建立
　　目的：新興的聯(lián)合門靜脈結(jié)扎和肝臟離斷的二步肝切除術(shù)(ALPPS)能刺激肝臟快速再生，但具體機(jī)制尚未闡明。近年來的研究表明,骨髓源肝血竇內(nèi)皮祖細(xì)胞(bone marrow derived liver sinusoidal endothelial progenitor cells，BM SPCs）的募集是肝再生的必要條件,而血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(v

2、ascular endothelial growth factor,VEGF)是這一過程的關(guān)鍵調(diào)控者。據(jù)此，我們推測BM SPCs可能在ALPPS術(shù)后肝再生中發(fā)揮著重要的作用。本課題，首先制備大鼠ALPPS術(shù)模型，經(jīng)組織學(xué)、肝功能和免疫組化染色評估術(shù)后肝再生情況;然后通過免疫熒光染色、PCR和Western Blot方法，觀察BM SPCs在ALPPS術(shù)后肝組織中的募集情況以及VEGF的表達(dá)情況，來評估BM SPCs在ALPPS術(shù)后肝再

3、生中的作用。
　　方法：90只健康的SD雄性大鼠隨機(jī)分為ALPPS手術(shù)組、肝臟門靜脈結(jié)扎組（PVL組）和假手術(shù)組（Sham手術(shù)組），每組各30只各組設(shè)置1、2、3、5和7天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)。ALPPS手術(shù)組采用門靜脈80％分支結(jié)扎以及原位離斷肝臟實(shí)質(zhì)制作ALPPS大鼠模型，PVL組為80％門靜脈結(jié)扎大鼠，Sham組為僅開腹后翻動(dòng)肝臟數(shù)次后即關(guān)腹。各組于各時(shí)相點(diǎn)處死動(dòng)物取材，取肝組織和血清進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：右中葉肝臟與大鼠體重比重的計(jì)算;HE

4、染色檢測肝組織病理變化，肝臟組織Ki-67免疫組化染色檢測肝臟細(xì)胞增殖情況;血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和總膽紅素(TBIL)測定檢測肝功能狀況。
　　結(jié)果：(1)ALPPS手術(shù)組與PVL手術(shù)組相比，在各時(shí)相點(diǎn)肝臟生長率均顯著升高(p＜0.05)。(2)ALPPS手術(shù)組與PVL手術(shù)組相比，肝臟組織損傷更嚴(yán)重并可見Ki-67陽性細(xì)胞明顯增多。(3)ALPPS手術(shù)組與PVL手術(shù)組相比，血清ALT、AST和TBIL水平

5、在術(shù)后第一天顯著升高(p＜0.05)，第三天開始顯著下降并回到正常水平。
　　第二部分：BM SPCs在大鼠ALPPS術(shù)后肝再生中的作用研究
　　目的：評估BM SPCs在大鼠ALPPS術(shù)后在肝再生中的作用規(guī)律。
　　方法：在第一部分取材肝組織和血清的基礎(chǔ)上，采用免疫熒光染色檢測骨髓源肝血竇內(nèi)皮祖細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD133、CD45和CD31的表達(dá)情況，通過PCR實(shí)驗(yàn)檢測肝臟組織中的血清肝生長因子(HGF)和VEGF的

6、mRNA表達(dá)水平，并進(jìn)一步用Western Blot方法檢測HGF和VEGF蛋白的表達(dá)情況。此外，測定了的HGF表達(dá)水平。
　　結(jié)果：(1)ALPPS手術(shù)后大鼠肝臟結(jié)扎側(cè)可見呈CD31+CD133+和CD45+CD133+陽性的骨髓源肝血竇內(nèi)皮祖細(xì)胞，但是在ALPPS手術(shù)組肝臟保留側(cè)、PVL組和Sham組中均未見CD31+CD133+和CD45+CD133+陽性的細(xì)胞。(2)ALPPS組與PVL組相比，大鼠肝臟組織HGF mRNA

7、水平顯著升高，并且ALPPS手術(shù)后大鼠肝臟保留側(cè)HGF mRNA水平隨著術(shù)后時(shí)間的延長而逐漸下降，與此相反，肝臟結(jié)扎側(cè)HGF mRNA表達(dá)水平隨著時(shí)間的推移一直升高;隨后Western Blot方法進(jìn)一步證實(shí)了HGF蛋白表達(dá)與其轉(zhuǎn)錄水平一致。(3)ALPPS組與PVL組相比，大鼠肝臟組織VEGF mRNA水平顯著升高，并且ALPPS手術(shù)后大鼠肝臟保留側(cè)VEGF mRNA水平隨著時(shí)間的推移一直下降，而肝臟結(jié)扎側(cè)VEGF mRNA表達(dá)水平在

8、術(shù)后第1天和第2天呈上升趨勢，并在第2天達(dá)到峰值，之后則隨著術(shù)后時(shí)間的延長而逐漸下降;隨后Western Blot方法檢測VEGF蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)ALPPS手術(shù)后的第1、2天和3天中，肝臟保留側(cè)的VEGF蛋白水平一直是低于肝臟結(jié)扎側(cè)，并且肝臟保留側(cè)的VEGF蛋白水平在術(shù)后第1天和第2天呈下降趨勢，然而自第3天起VEGF蛋白水平反而開始上升;肝臟結(jié)扎側(cè)VEGF蛋白水平的表達(dá)與其轉(zhuǎn)錄水平一致。
　　結(jié)論：1、ALPPS術(shù)后肝組織再生顯著提