CRP2在TNF-α介導(dǎo)的A549細(xì)胞炎癥-氧化損傷中對Nox1基因的表達(dá)調(diào)控.pdf

1、研究背景：
　　炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，炎癥失衡往往伴隨氧化應(yīng)激損傷，在生物進(jìn)化中，炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激應(yīng)相對協(xié)調(diào)，既可有效清除抗原，又使炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激維持在合理水平，減少組織細(xì)胞的損傷。如打破炎癥與氧化應(yīng)激的平衡，將對生物機(jī)體造成巨大的損傷。眾多文獻(xiàn)表明炎癥反應(yīng)失控和氧化應(yīng)激過度激活是急性肺損傷（acute lung injury，ALI）重要的發(fā)病機(jī)制，對炎癥反應(yīng)及繼發(fā)的氧化應(yīng)激進(jìn)行調(diào)控是減輕ALI的關(guān)鍵。急性呼吸窘迫綜

2、合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是嚴(yán)重的ALI，在過去的幾十年中，盡管人們對ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識和臨床救治措施方面有了長足的進(jìn)步，但ARDS患者的死亡率仍居高不下。因本病起病急驟，發(fā)展迅速，病死率高，尋找有效的ALI/ARDS治療新策略仍是當(dāng)前危重病醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和迫切任務(wù)。
　　肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞作為呼吸膜的重要組成，是肺泡上皮的“干細(xì)胞”，可化生為I型肺泡上皮

3、細(xì)胞合成并分泌表面活性物質(zhì)維持肺泡正常形態(tài)。在急性肺損傷中減輕炎癥反應(yīng)并繼發(fā)的氧化損傷對維持肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整及增殖修復(fù)具有重要作用，從而可減輕急性肺損傷的發(fā)生和進(jìn)展。在 ARDS小鼠模型中，炎癥和氧化應(yīng)激水平呈正相關(guān)，且肺臟是過度氧化應(yīng)激首要打擊的靶器官，肺組織活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平高的小鼠肺部損傷更嚴(yán)重。Syrkina等研究發(fā)現(xiàn)，ARDS小鼠早期即出現(xiàn)氧化與抗氧化失衡，抗氧化劑乙

4、酰半胱氨酸能抑制ARDS小鼠肺內(nèi)還原型谷胱甘肽的下降，減輕中性粒細(xì)胞浸潤，降低肺泡灌洗液中炎癥因子的水平，減少氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡。此外ROS的大量生成后可介導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的生成。TNF-α是介導(dǎo)ALI的早期細(xì)胞因子之一，且 TNF-α是啟動和放大炎癥反應(yīng)的主要炎癥介質(zhì)，TNF-α能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，對結(jié)構(gòu)細(xì)胞造成氧化損傷，最終引起細(xì)胞壞死。研究證實動物模型中血清或肺泡灌洗液中TNF-α濃度與ALI

5、嚴(yán)重程度正相關(guān)。急性肺損傷往往伴隨肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞的損傷，因此本研究沿用既往本實驗室使用的具有代表性的炎癥因子 TNF-α刺激肺泡上皮細(xì)胞 A549體外復(fù)制ALI時肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞損傷的炎癥-氧化損傷模型。
　　煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase, Nox）是催化生成ROS的重要氧化酶。已有眾多研究表明Nox活化，使H2O2大量生成，并引起細(xì)胞損傷。目前發(fā)現(xiàn)存在Nox1-5等亞型，其中Nox1主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞。本

6、實驗室前期研究轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、SP1對Nox1的調(diào)控中，沉默NF-κB、SP1后能降低 Nox1的表達(dá)，且能降低活性氧的表達(dá)，降低細(xì)胞的凋亡率。Nox1是活性氧產(chǎn)生的重要來源，且基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達(dá)最關(guān)鍵的步驟，因此對Nox1轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，使其活性氧在炎癥反應(yīng)時維持較低水平，能減輕內(nèi)源性活性氧的生成，減輕對細(xì)胞的氧化損傷。
　　本實驗室前期在研究TNF-α刺激 A549細(xì)胞 Nox1啟動子差異結(jié)合蛋白的篩選實驗中，以T

7、NF-α刺激肺泡上皮細(xì)胞，模擬急性肺損傷體外細(xì)胞炎癥-氧化損傷模型，通過DNA-pull down、二維凝膠電泳及質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)Nox1啟動子區(qū)域差異結(jié)合蛋白13種，我們選取了其中一個具有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白 CRP2，其編碼基因為 CSRP2。CRP2由193個氨基酸組成，分子量約為21KD，CRP2蛋白的特點(diǎn)是含有2個LIM結(jié)構(gòu)域，每個LIM結(jié)構(gòu)域后跟著一個由12個氨基酸殘基組成的甘氨酸豐富的重復(fù)序列，兩個 LIM結(jié)構(gòu)域之間還有一個核定位信

8、號(KKYGPK)。CPR2屬于 LIM蛋白，LIM蛋白是一類富含半胱氨酸、具有一個或多個鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白，目前發(fā)現(xiàn)的LIM蛋白已有60多種，參與了細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞骨架功能調(diào)節(jié)等多種生理效應(yīng)。LIM蛋白分為四類：LIM-HD，LIM-Only，LIM-K和含一端 LIM結(jié)構(gòu)域的LIM蛋白。CRP屬于LIM-Only蛋白，其特點(diǎn)是含有一個或多個 LIM結(jié)構(gòu)域，但無 DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，故CRP2雖為具有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白，但不具有與DNA

9、直接結(jié)合的能力。CRP2可定位于細(xì)胞胞漿及胞核，至今為止文獻(xiàn)報道CRPs能和核蛋白結(jié)合，特別是與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，并且CRP2本身也是其重要的轉(zhuǎn)錄因子。關(guān)于CSRP家族的研究，早期一直聚焦在平滑肌細(xì)胞，后來逐漸擴(kuò)展到動、靜脈血管平滑肌細(xì)胞。后來，J?rvinen PM等研究發(fā)現(xiàn)在特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化小鼠肺內(nèi)發(fā)現(xiàn)CRP1/CRP2的表達(dá)。本實驗室前期通過構(gòu)建CSRP2真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，通過免疫熒光實驗顯示CRP2蛋白在TNF-α刺激

10、1h下活化后濃聚于核膜，并部分入核，同時伴有活性氧生成減少。我們推測CRP2在TNF-α的刺激下活化入核并參與了對Nox1基因的調(diào)控。
　　目前為止尚沒有文獻(xiàn)表明 CRP2直接作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，但其可通過具有調(diào)節(jié)作用的靶蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。Kong等[18]研究表明，定位于核的CRP2可調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的MyoD轉(zhuǎn)錄因子家族；Yet等研究表明，在CSRP2的5’端有一潛在的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，具有與GATA、SP

11、1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的可能，瞬時轉(zhuǎn)染CSRP2可顯著提高大鼠動脈平滑肌細(xì)胞熒光素酶活性，但具體機(jī)制仍未見明顯文獻(xiàn)報道。另有文獻(xiàn)報道 CRP2能與SRF和GATA-6形成復(fù)合體后參與對基因的調(diào)控，并且CRP2在調(diào)控過程中起到轉(zhuǎn)錄輔因子的作用。在平滑肌細(xì)胞，CRP2可被 SRF、hlcalponin、SM22等因子激活而活化，通過其C端LIM結(jié)構(gòu)域作為SRF與GATA6的橋接分子誘導(dǎo)平滑肌的轉(zhuǎn)分化。
　　綜合國內(nèi)外文獻(xiàn)的報道后，我們利用生

12、物信息學(xué)軟件分析結(jié)果顯示，我們前期構(gòu)建Nox1啟動子區(qū)域（1415bp）范圍內(nèi)存在兩個SRF結(jié)合元件，而無GATA6的結(jié)合位點(diǎn)。我們推測CRP2活化入核后可能通過與SRF結(jié)合，共同調(diào)控Nox1的轉(zhuǎn)錄過程。明確CRP2對Nox1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，通過調(diào)節(jié)CSRP2的活性調(diào)控Nox1的活性，從而調(diào)控活性氧的生成。CRP2對Nox1轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的闡明為ARDS過程中炎癥繼發(fā)氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
　　研究目的：評估CRP2作為轉(zhuǎn)錄因

13、子是否直接或間接參與了對Nox1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；探討CRP2在TNF-α介導(dǎo)的A549細(xì)胞中對Nox1活化表達(dá)的調(diào)控機(jī)制；探索CRP2在Nox1啟動子區(qū)域的結(jié)合方式。
　　方法：
　　1.Nox1啟動子區(qū)差異結(jié)合蛋白CRP2的確認(rèn)及活性鑒定
　　1.1 制備生物素標(biāo)記Nox1啟動子DNA探針PGL3-Basic-Nox1重組質(zhì)粒為本實驗室前期所保存，按分子克隆的方法擴(kuò)增PGL3-Basic-Nox1重組質(zhì)粒，提取 PGL3

14、-Basic-Nox1重組質(zhì)粒作為模板，PCR的方法制備生物素標(biāo)記Nox1啟動子探針，PCR產(chǎn)物行1％瓊脂糖凝膠電泳，按大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作說明切膠回收Nox1啟動子DNA探針。
　　1.2 DNA pull-down實驗實驗分組：對照組、TNF-α刺激組。
　　將3~5代生長良好的A549細(xì)胞以1×105/ml接種于15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，待貼壁細(xì)胞融合至70%~80%時，更換為含3%血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8~12h

15、（饑餓處理）， TNF-α刺激組細(xì)胞給予含 TNF-α（10ng/ml）的3%血清培養(yǎng)基、對照組給予等量含3%血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，刺激1h后收集細(xì)胞沉淀。按照武漢博士德胞漿、胞核蛋白抽提試劑盒說明書進(jìn)行胞漿胞核蛋白抽提，按BCA說明書測定核蛋白濃度。將兩組核蛋白按Dynabeads kilobase BINDERTMKit說明書進(jìn)行DNA pull-down實驗，將細(xì)胞核蛋白Nox1啟動子區(qū)結(jié)合蛋白洗脫。
　　1.3 Wester

16、n-blot法檢測差異蛋白CRP2的表達(dá)實驗分組：對照組、TNF-α刺激組。Western-blot檢測洗脫蛋白CRP2的表達(dá)水平。
　　1.4 構(gòu)建并鑒定真核表達(dá)質(zhì)粒PcDNA3-CSRP2-HA據(jù)GeneBank中人CSRP2 CDS序列設(shè)計并合成引物，提取A549細(xì)胞總RNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得CSRP2目的基因后，再與PcDNA3-HA載體進(jìn)行連接重組，構(gòu)建 PcDNA3-CSRP2-HA

17、真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化、PCR及 DNA序列測序分析等方法鑒定后，瞬時轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，Western blot法檢驗CSRP2蛋白表達(dá)。
　　1.5 熒光素酶報告基因檢測CRP2對Nox1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的影響實驗分組：
　　A.空白組（無轉(zhuǎn)染組）
　　B.轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1組C.轉(zhuǎn)染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1組D. TNF-α刺激組

18、E.轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α刺激組F.轉(zhuǎn)染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α刺激組將 A549細(xì)胞以1×105/ml接種于24孔板，待長至80%~90%時，按Lipofectamine LTX plus的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，共轉(zhuǎn)染時分別進(jìn)行pcDNA3-CSRP2-HA/ pcDNA3-HA質(zhì)粒和PGL3-Basic-Nox1質(zhì)粒（本實驗前期構(gòu)建）共轉(zhuǎn)染入A5

19、49細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6h后換液繼續(xù)培養(yǎng)4h，TNF-α組給予終濃度為10ng/ml的TNF-α培養(yǎng)基500ul，對照組加入等量1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后檢測熒光素酶活性。
　　2.CRP2對TNF-α介導(dǎo)的A549細(xì)胞中Nox1基因的調(diào)控
　　2.1 CSRP2沉默對Nox1基因mRNA、蛋白表達(dá)水平的影響實驗分組:空白組（不加任何干預(yù)因素）、TNF-α組（僅用TNF-α刺激）、CSRP2 siRNA組（預(yù)轉(zhuǎn)染CSRP2 s

20、iRNA且用TNF-α刺激）、siRNA control陰性對照組（預(yù)轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA且用TNF-α刺激）。RT-PCR檢測CSRP2 mRNA沉默效率及沉默后A549細(xì)胞的Nox1 mRNA水平；Western-blot法檢測總Nox1、胞漿胞核CRP2蛋白的表達(dá)水平。
　　2.2 CSRP2沉默對活性氧表達(dá)水平的影響實驗分組：同3.2.1。DCFH-DA法檢測A549細(xì)胞ROS表達(dá)水平，同時用熒光顯微鏡采集圖像。

21、　　3.CRP2在Nox1啟動子區(qū)域結(jié)合方式的研究
　　3.1 缺失不同SRF結(jié)合位點(diǎn)的Nox1啟動子螢光素酶表達(dá)載體的構(gòu)建以前期構(gòu)建的PGL3-Basic-Nox1（Nox1基因啟動子全長1415bp）為模板，設(shè)計兩個不同缺失SRF結(jié)合位點(diǎn)的引物，及兩個SRF結(jié)合位點(diǎn)同時缺失的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物連接到PGL3-Basic表達(dá)載體，進(jìn)行測序驗證。
　　3.2 缺失不同SRF結(jié)合位點(diǎn)的Nox1啟動子片段螢光素酶表

22、達(dá)載體的活性鑒定。采用螢光素酶報告系統(tǒng)檢測相對螢光素酶活性。實驗分組：
　　A.空白組
　　B. TNF-α刺激組C.轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α刺激組D.轉(zhuǎn)染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α刺激組E.轉(zhuǎn)染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-SRF1結(jié)合位點(diǎn)缺失+TNF-α刺激組F.轉(zhuǎn)染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-

23、Basic–SRF2結(jié)合位點(diǎn)缺失+TNF-α刺激組G.轉(zhuǎn)染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-SRF（1、2）結(jié)合位點(diǎn)同時缺失+TNF-α刺激組3.4統(tǒng)計學(xué)方法采用 spss13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X?s）表示。CSRP2沉默對Nox1基因mRNA、蛋白、活性氧表達(dá)水平的影響檢測用單因素方差分析。首先進(jìn)行方差齊性和總體組間差異檢驗，總體有差異后，進(jìn)行多重比較，方差齊用LSD，方差不齊用

24、Dunnett檢驗。涉及轉(zhuǎn)染DNA質(zhì)粒及TNF-α刺激等多個處理因素的實驗中，統(tǒng)計學(xué)方法采用析因分析，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.Nox1啟動子區(qū)差異結(jié)合蛋白CRP2的確認(rèn)及活性鑒定
　　1.1 TNF-α組的CRP2蛋白表達(dá)水平較空白組明顯上調(diào)。
　　1.2 成功構(gòu)建 pcDNA3-CSRP2-HA真核表達(dá)質(zhì)粒， Western-blot結(jié)果顯示pcDNA3.1-CSRP2-HA能夠在A54

25、9細(xì)胞中表達(dá)。
　　1.3 經(jīng)單因素方差分析，靜息狀態(tài)下，pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著低于pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1轉(zhuǎn)染組，而顯著高于空白組（F=260.753，P=0.000）；在TNF-α刺激下，轉(zhuǎn)染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α組熒光素酶活性顯著低于轉(zhuǎn)染 pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox

26、1+TNF-α轉(zhuǎn)染組，而顯著高于TNF-α組（F=446.061，P=0.000）。經(jīng)單因素方差分析，TNF-α刺激后，TNF-α組較空白對照組(即無轉(zhuǎn)染組)熒光素酶活性顯著升高（F=54.753，P=0.002）；轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α組熒光素酶活性高于轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1組（F=360.488，P=0.000）；轉(zhuǎn)染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3

27、-Basic-Nox1+TNF-α組組熒光素酶活性高于轉(zhuǎn)染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1組（F=117.988，P=0.000）。經(jīng)析因分析，TNF-α與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩種處理因素間有交互效應(yīng)（F=15.000，P=0.010）。
　　2.CRP2對TNF-α介導(dǎo)的A549細(xì)胞中Nox1基因的調(diào)控
　　2.1 各組A549細(xì)胞CSRP2 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=800.366， P=0

28、.000）。經(jīng)TNF-α刺激，A549細(xì)胞CSRP2 mRNA表達(dá)水平較空白對照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。預(yù)轉(zhuǎn)染CSRP2 siRNA組，A549細(xì)胞CSRP2 mRNA表達(dá)水平較空白對照組、TNF-α組、陰性對照組下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.2 各組A549細(xì)胞CRP2胞漿蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=62.081， P=0.000）。經(jīng)TNF-α刺激，A549細(xì)胞胞漿CRP2蛋白表達(dá)水

29、平較空白對照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。預(yù)轉(zhuǎn)染CSRP2 siRNA組，A549細(xì)胞胞漿CRP2蛋白表達(dá)水平較 TNF-α組、陰性對照組下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.3 各組A549細(xì)胞CRP2胞核蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=45.609， P=0.000）。經(jīng)TNF-α刺激，A549細(xì)胞胞核CRP2蛋白表達(dá)水平較空白對照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。預(yù)轉(zhuǎn)染CSRP2 siRNA

30、組，A549細(xì)胞胞核CRP2蛋白表達(dá)水平較 TNF-α組、陰性對照組下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.4 各組A549細(xì)胞Nox1 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=298.868， P=0.000）。經(jīng)TNF-α刺激，A549細(xì)胞Nox1 mRNA表達(dá)水平較空白對照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。預(yù)轉(zhuǎn)染CSRP2 siRNA組，A549細(xì)胞Nox1 mRNA表達(dá)水平較空白對照組、TNF-α組、陰性對

31、照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.5 各組 A549細(xì)胞 Nox1蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=39.094， P=0.000）。經(jīng)TNF-α刺激，A549細(xì)胞Nox1蛋白表達(dá)水平較空白對照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。預(yù)轉(zhuǎn)染CSRP2 siRNA組，A549細(xì)胞Nox1蛋白表達(dá)水平較空白對照組、TNF-α組、陰性對照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.6 各組A549細(xì)胞

32、活性氧表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=29.121，P=0.000）。經(jīng)TNF-α刺激，A549細(xì)胞活性氧表達(dá)水平較空白對照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。預(yù)轉(zhuǎn)染CSRP2 siRNA組，A549細(xì)胞活性氧表達(dá)水平較空白對照組、TNF-α組、陰性對照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　各組A549細(xì)胞活性氧表達(dá)陽性百分比有統(tǒng)計學(xué)意義（F=148.167，P=0.000）。經(jīng)TNF-α刺激，A549細(xì)胞活性氧活性

33、氧陽性百分比表達(dá)水平較空白對照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。預(yù)轉(zhuǎn)染CSRP2 siRNA組，A549細(xì)胞活性氧表達(dá)水平較空白對照組、TNF-α組、陰性對照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.CRP2在Nox1啟動子區(qū)域結(jié)合方式的研究
　　3.1 成功構(gòu)建了不同SRF結(jié)合位點(diǎn)缺失的Nox1啟動子熒光素酶表達(dá)載體。
　　3.2 經(jīng)單因素方差分析各組A549細(xì)胞熒光素酶活性表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義

34、（F=31.788，P=0.000）。經(jīng)TNF-α刺激，A549細(xì)胞熒光素酶活性表達(dá)水平較空白對照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。預(yù)轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α組較空白組和TNF-α刺激組，A549細(xì)胞熒光素酶活性表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。預(yù)轉(zhuǎn)染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α組，A549細(xì)胞熒光素酶活性表達(dá)水平較預(yù)轉(zhuǎn)染p

35、cDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α組下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。預(yù)轉(zhuǎn)染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1-SRF1結(jié)合位點(diǎn)缺失+TNF-α組較pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α組，A549細(xì)胞熒光素酶活性表達(dá)水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。預(yù)轉(zhuǎn)染PcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-SRF2結(jié)合位點(diǎn)缺失+TNF

36、-α組， A549細(xì)胞熒光素酶活性表達(dá)水平較PcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α組、PcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1-SRF1結(jié)合位點(diǎn)缺失+TNF-α組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。預(yù)轉(zhuǎn)染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1-SRF(1、2)結(jié)合位點(diǎn)同時缺失+TNF-α組較pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-No