小分子RNA-195通過負(fù)性調(diào)控S6K1的表達(dá)抑制人類前列腺癌的進(jìn)展.pdf

1、目的:
　　本研究旨在探索miR-195在前列腺癌中的作用及其調(diào)控的靶基因。
　　材料:
　　1.人臨床組織來源:12對配對的原發(fā)性前列腺癌及癌旁良性冰凍前列腺組織從廣州市第一人民醫(yī)院組織庫獲得。
　　2.動(dòng)物:20只年齡在4-5周的BALB/c雄性裸鼠購買于廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
　　3.細(xì)胞株:3種前列腺癌細(xì)胞株(PC3/DU145/LNCaP)是2012年從美國馬納薩斯(Manassas，VA，USA

2、)的American Type Culture Collection(ATCC)公司購買得到，而良性的前列腺上皮細(xì)胞系PrEC是從Lonza公司購買。
　　方法:
　　1.慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DU145和LNCaP構(gòu)建miR-195過表達(dá)和抑制表達(dá)的細(xì)胞株;核酸或質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染DU145和LNCaP構(gòu)建靶基因S6K1、miR-195和靶基因S6K1同時(shí)過表達(dá)等細(xì)胞株。
　　2.Taylor公用數(shù)據(jù)庫分析miR-195的表達(dá)

3、水平與人前列腺癌的臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。
　　3.細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)分析miR-195在體外對前列腺癌細(xì)胞功能的影響，以及靶基因S6K1能否拮抗miR-195對前列腺癌細(xì)胞引起的效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)。裸鼠皮下接種DU145和LNCaP細(xì)胞株形成裸鼠皮下移植瘤模型，用于分析miR-195在體內(nèi)對前列腺癌成瘤和轉(zhuǎn)移方面的影響。
　　4.iTRAQ技術(shù)對穩(wěn)定過表達(dá)miR-195和空白對照的LNCaP

4、細(xì)胞株進(jìn)行質(zhì)譜分析，探索由miR-195引起的差異表達(dá)的蛋白。結(jié)合IPA軟件和GO功能分析差異蛋白所涉及的信號(hào)通路和分子生物學(xué)功能。
　　5.miRNAs靶基因預(yù)測軟件Target-Scan、miRWalk和miRanda同時(shí)預(yù)測受miR-195調(diào)控的靶基因;熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)確認(rèn)miR-195直接調(diào)控的靶基因。
　　6.qRT-PCR檢測miR-195過表達(dá)和空白對照的LNCaP細(xì)胞株中候選靶基因S6K1、SMAP2、DCU

5、N1D1、SMAD4、IPO9、CAPZA2和 CPNE1的表達(dá)水平。qRT-PCR分別檢測前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、DU145和LNCaP，正常前列腺上皮細(xì)胞株P(guān)rEC，以及12對前列腺癌和對應(yīng)的癌旁良性前列腺組織的miR-195和靶基因S6K1的表達(dá)水平。
　　7.Western bolt檢測miR-195異常表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株以及裸鼠皮下移植瘤組織中靶基因S6K1的蛋白水平;Western bolt檢測靶基因S6

6、K1表達(dá)異常的相關(guān)細(xì)胞株構(gòu)建是否成功;Western bolt檢測miR-195過表達(dá)或S6K1被抑制表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株中靶基因S6K1下游已被研究證實(shí)的潛在效應(yīng)因子MMP-9、VEGF、BAD和E-cadherin的蛋白水平。
　　8.免疫組織化學(xué)分析S6K1在包含225例人前列腺癌和25例癌旁良性前列腺癌的組織芯片的表達(dá)情況;免疫組織化學(xué)分析miR-195異常表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株接種形成的裸鼠皮下

7、腫瘤組織中CD31和Vimentin的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.相對正常前列腺上皮細(xì)胞株P(guān)rEC，miR-195在PC3、DU145和LNCaP細(xì)胞株中的表達(dá)量均顯著性下調(diào)(P＜0.001); miR-195在人臨床前列腺癌組織中的表達(dá)量相對于癌旁良性前列腺組織的表達(dá)量同樣顯著性下調(diào)(P=0.020)。
　　2.利用Taylor公用數(shù)據(jù)庫分析顯示miR-195的表達(dá)水平跟前列腺癌Gleason評(píng)分成顯著性負(fù)相關(guān)(

8、P=0.001)，miR-195表達(dá)水平的下調(diào)與前列腺癌根治術(shù)后發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及生化復(fù)發(fā)密切相關(guān)(P=0.01，0.009)，然而，miR-195的表達(dá)水平與患者的術(shù)前血清PSA濃度、腫瘤臨床分期、腫瘤病理分期以及是否死亡不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性。Kaplan-Meier和Log rank方法顯示miR-195的表達(dá)水平與患者的總體生化復(fù)發(fā)率和無轉(zhuǎn)移生化復(fù)發(fā)率存在顯著性負(fù)相關(guān)(P=0.001，0.009)，但與患者的總體生存率和無轉(zhuǎn)移生存

9、率不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性(P=0.721，0.806)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型單因素分析結(jié)果提示腫瘤病理分期、Gleason評(píng)分和miR-195的表達(dá)水平都是預(yù)測前列腺癌患者接受前列腺癌根治術(shù)后出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)，而年齡、術(shù)前血清PSA水平、腫瘤臨床分期不能作為判斷前列腺癌預(yù)后的預(yù)測因子。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析結(jié)果提示miR-195表達(dá)水平[HR:0.58(0.39-0.85)]、Gleason評(píng)分[HR:5.83(2.

10、71-12.54)]和病理分期[2.71(1.09-6.71)]能夠作為預(yù)測生化復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立指標(biāo)。
　　3.體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)顯示miR-195過表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株的增殖、遷移、侵襲能力相對空白對照組明顯下降，而發(fā)生凋亡的比率明顯增加。相反，miR-195抑制表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株的增殖、遷移、侵襲能力相對對照組明顯增加，而發(fā)生凋亡的比率明顯降低(P＜0.05)。
　　4.裸鼠皮下移植瘤模型顯示m

11、iR-195過表達(dá)能夠顯著性抑制由DU145和LNCaP形成的移植瘤的成瘤大小和生長速度(P＜0.05);相反，miR-195的表達(dá)被抑制后移植瘤成瘤大小比對照組大，且生長速度加快。免疫組化分析結(jié)果顯示miR-195能夠顯著性抑制移植瘤組織中新生血管指標(biāo)CD31和腫瘤侵襲力指標(biāo)Vimentin的表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　5.iTRAQ發(fā)現(xiàn)的差異性表達(dá)蛋白總共有3194個(gè)，其中有78個(gè)蛋白的差異表達(dá)倍數(shù)≤-1.5或≥1.5(m

12、iR-195 vs miR-NC)，包括28個(gè)上調(diào)蛋白和50個(gè)下調(diào)蛋白。IPA軟件的KEGG通路分析顯示大部分上調(diào)蛋白參與代謝類的通路，例如檸檬酸循環(huán)、纈氨酸降解、丙氨酸生物合成、輔酶生物合成和脂肪酸氧化。大部分下調(diào)的蛋白參與mTOR通路、IL-8通路、AMPK通路和IGF-1通路等腫瘤相關(guān)通路。GO功能會(huì)聚系統(tǒng)分析結(jié)果顯示差異蛋白涉及的與腫瘤相關(guān)的生物學(xué)功能包括細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。
　　6.3個(gè)miRNA

13、s靶基因軟件共同預(yù)測50個(gè)下調(diào)蛋白中可能被miR-195調(diào)控的候選靶基因，結(jié)果顯示SMAP2、DCUN1D1、SMAD4、IP09、S6K1、CAPZA2和CPNE1為候選靶基因。qRT-PCR結(jié)果顯示SMAP2、S6K1、IP09和DCUN1D1在miR-195過表達(dá)的LNCaP細(xì)胞株和裸鼠皮下移植瘤組織中表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步揭示S6K1是miR-195直接調(diào)控的靶基因(P＜0.001)。 qRT-PCR和

14、western blot證實(shí)miR-195和S6K1在前列腺癌細(xì)胞株、移植瘤和人臨床前列腺癌組織中的基因和蛋白表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系。
　　7.體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)示S6K1過表達(dá)可以拮抗miR-195對前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，以及減緩miR-195對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用(P＜0.05)。另外，siRNA抑制S6K1的表達(dá)后在體外對前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡功能的影響與miR-195對前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)一

15、致(P＜0.05)。這些結(jié)果進(jìn)一步揭示了S6K1可能是miR-195發(fā)揮抑制前列腺癌進(jìn)展作用下游重要的媒介。
　　8.組織芯片免疫染色分析顯示前列腺癌組織標(biāo)本的S6K1陽性表達(dá)率[174/225(77.3％)]顯著高于癌旁良性前列腺組織[10/25(40％)](x2=16.140，P＜0.001); S6K1的陽性表達(dá)與前列腺癌患者的病理分期較晚(x2=4.396，P=0.036)、手術(shù)切緣陽性(x2=5.371，P=0.02)、

16、生化復(fù)發(fā)(x2=5.696，P=0.017)和總體生存率降低(x2=5.417，P=0.02)有關(guān)。Kaplan-Meier和Log rank方法分析結(jié)果顯示S6K1的陽性表達(dá)跟患者總體無生化復(fù)發(fā)生存率和總體生存率降低有關(guān)(P=0.011，0.022)，但與無轉(zhuǎn)移生存率的降低不存在相關(guān)性(P=0.058)。
　　COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型顯示S6K1可作為預(yù)測前列腺癌患者無生化復(fù)發(fā)生存率和總體生存率的獨(dú)立指標(biāo)，HR(95％ CI)分別

17、是2.041(1.098-3.792)和2.992(1.058-8.462)。
　　9.在前列腺癌細(xì)胞株LNCaP和DU145中，抑制S6K1的表達(dá)或miR-195過表達(dá)均可以導(dǎo)致MMP-9和VEGF的蛋白水平下降，而E-cadherin和BAD的蛋白水平上調(diào)，這結(jié)果說明MMP-9、VEGF、E-cadherin和BAD是miR-195-S6K1軸下游的重要效應(yīng)因子。
　　結(jié)論:
　　1.miR-195在前列腺癌中是一

18、個(gè)重要的抑癌基因;miR-195通過負(fù)性調(diào)控S6K1的表達(dá)抑制人類前列腺癌的進(jìn)展。
　　2.miR-195和S6K1均可單獨(dú)作為預(yù)測患者在接受前列腺癌根治術(shù)后出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo);S6K1還可單獨(dú)作為預(yù)測前列腺癌患者總體生存時(shí)間長短的指標(biāo)?？傊型ㄟ^檢測前列腺癌組織中miR-195和S6K1的表達(dá)水平，協(xié)助傳統(tǒng)的臨床病理指標(biāo)更準(zhǔn)確地區(qū)分低度惡性和高度惡性的前列腺癌，優(yōu)化治療方案。
　　3.miR-195-S6K1信號(hào)軸