長(zhǎng)鏈非編碼RNA PlncRNA-1作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA調(diào)控雄激素受體表達(dá)促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本研究構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)及干擾PlncRNA-1的前列腺癌細(xì)胞株，并在細(xì)胞水平及動(dòng)物水平明確了其促癌的功能。運(yùn)用了Real-time PCR及Northernblot鑒定了PlncRNA-1的優(yōu)勢(shì)剪切體，以及運(yùn)用原位雜交實(shí)驗(yàn)以及核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了PlncRNA-1在細(xì)胞中的定位，運(yùn)用miRanda預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行靶向PlncRNA-1的miRNA的預(yù)測(cè)，然后用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)能與PlncRNA-1相互作用的miR-34c-

2、5p，以及miR-297-3p，并應(yīng)用Real-time PCR發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)miRNA同樣能靶向AR，并在體外水平研究了這兩個(gè)miRNA在對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖以及凋亡的作用，并檢測(cè)在人前列腺癌組織中PlncRNA-1以及這兩個(gè)miRNA的表達(dá)量并分析其相關(guān)性。本研究將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)及干擾PlncRNA-1的前列腺癌細(xì)胞株在裸鼠上進(jìn)行荷瘤，發(fā)現(xiàn)其促癌作用體內(nèi)及體外一致。進(jìn)一步機(jī)制研究表明PlncRNA-1的優(yōu)勢(shì)功能剪切體為最短的一條(V3)，并

3、且其主要富集在胞質(zhì)，通過(guò)miRanda預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行PlncRNA-1靶位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，本研究為其篩到了能與之相互作用的miR-34c-5p以及miR-297-3p，并且發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)miRNA能與雄激素受體作用，并且能抑制前列腺細(xì)胞的增殖以及促進(jìn)其凋亡，與PlncRNA-1的作用相反。同時(shí)在人前列腺癌與癌旁組織中發(fā)現(xiàn)PlncRNA-1在癌組織中的表達(dá)量與這兩個(gè)miRNA的表達(dá)是呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的，與AR是呈現(xiàn)正相關(guān)的，并在前列腺癌病人的血漿中檢測(cè)到這

4、條lncRNA的表達(dá)量是高于非前列腺癌病人。本研究證實(shí)PlncRNA-1作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA(ceRNA)，通過(guò)抑制miR-34c-5p，miR-297-3p來(lái)促進(jìn)AR的表達(dá)，從而促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展，首次報(bào)道前列腺癌中的長(zhǎng)鏈非編碼RNA能作為ceRNA與雄激素受體作用的機(jī)制，并提示了PlncRNA-1可能作為前列腺癌治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)以及可能作為診斷前列腺癌的生物標(biāo)志物。
　　第一部分 長(zhǎng)鏈非編碼RNA PlncRNA-1的鑒定<

5、br>　　方法:(1)通過(guò)UCSC基因數(shù)據(jù)庫(kù)顯示PlncRNA-1的具體基因定位及轉(zhuǎn)錄剪切體。(2)利用RT-PCR和Nothem blot進(jìn)行PlncRNA-1剪切體的的檢測(cè)，并且在泌尿系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞系中進(jìn)行檢測(cè)。(3)利用FISH和核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)對(duì)PlncRNA-1進(jìn)行細(xì)胞定位。(4)利用RT-PCR和Westem Blot對(duì)PlncRNA-1和AR的關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。(5)通過(guò)RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PlncRNA-1和AR是否直接結(jié)合。
　

6、　結(jié)果:(1)發(fā)現(xiàn)PlncRNA-1共有三條轉(zhuǎn)錄剪切體，而且長(zhǎng)度各異，分別是CBR3-AS1v1(1575bp)，CBR3-AS1 v2(1500bp)以及CBR3-AS1 v3(743bp)。(2)發(fā)現(xiàn)v3是前列腺癌中表達(dá)最高的，也是之前報(bào)道過(guò)有功能的PlncRNA-1.并且在泌尿系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)量最高。(3) FISH和核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PlncRNA-1主要位于細(xì)胞質(zhì)。(4)在LNCaP和22RV1細(xì)胞中干擾PlncRNA-1后

7、，AR mRNA及蛋白的表達(dá)是下調(diào)的。過(guò)表達(dá)PlncRNA-1后，AR mRNA及蛋白的表達(dá)是上調(diào)的。(5) RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PlncRNA-1和AR不能結(jié)合。
　　結(jié)論:PlncRNA-1是CBR3-AS1 v3，主要位于細(xì)胞質(zhì)，能夠調(diào)控AR的表達(dá)，但是不能與AR直接結(jié)合。
　　第二部分 AR對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA PlncRNA-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用研究
　　方法:(1)通過(guò)在LNCaP細(xì)胞中添加10nM DHT后檢測(cè)不同時(shí)

8、間PlncRNA-1的表達(dá)量。同時(shí)以不同濃度梯度的DHT，分別是0，0.01，1，10，100nM的雄激素去刺激LNCaP細(xì)胞48h后，檢測(cè)PlncRNA-1的表達(dá)量。(2)同時(shí)利用干擾RNA，在LNCaP中干擾AR，檢測(cè)PlncRNA-1的表達(dá)。(3)構(gòu)建PlncRNA-1的啟動(dòng)子到報(bào)告基因上，并用雄激素及雄激素拮抗劑加入到細(xì)胞中檢測(cè)報(bào)告基因的活性。(4)通過(guò)PROMO預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)PlncRNA-1啟動(dòng)子上是否有AR的結(jié)合位點(diǎn)，并利用

9、染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PlncRNA-1的啟動(dòng)子能與AR是否結(jié)合。
　　結(jié)果:(1)發(fā)現(xiàn)加入DHT后，LNCaP細(xì)胞中的PlncRNA-1的表達(dá)量隨著時(shí)間是上調(diào)的，加入不同濃度的DHT刺激LNCaP后，發(fā)現(xiàn)PlncRNA-1的表達(dá)量也是隨著濃度的增加而不斷上調(diào)。(2)在LNCaP細(xì)胞中干擾AR后，發(fā)現(xiàn)PlncRNA-1的表達(dá)也是下調(diào)的。(3)加入雄激素后，報(bào)告基因的活性是上調(diào)的，加入雄激素抑制劑后，報(bào)告基因的活性是下調(diào)的。(4)

10、通過(guò)PROMO預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)出在PlncRNA-1的啟動(dòng)子上游1500bp的區(qū)域有三個(gè)預(yù)測(cè)位點(diǎn)。同時(shí)通過(guò)CHIP驗(yàn)證出了這三個(gè)位點(diǎn)確實(shí)能與AR結(jié)合。
　　結(jié)論:體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)長(zhǎng)鏈非編碼PlncRNA-1是AR啟動(dòng)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。
　　第三部分 PlncRNA-1促進(jìn)AR表達(dá)上調(diào)的內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA機(jī)制研究
　　方法:(1)生物信息學(xué)分析篩選出靶向PlncRNA-1的miRNA。(2)利用干擾RNA技術(shù)干擾PlncRNA-

11、1后，RT-PCR檢測(cè)篩選出的miRNA的表達(dá)，初步篩選出與PlncRNA-1作用的miRNA.(3)通過(guò)在LNCaP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-297-3p，miR-34c-5pmimics驗(yàn)證是否能與PlncRNA-1和AR相互作用。(4)通過(guò)生物信息學(xué)將這兩條miRNA靶向AR3'UTR的區(qū)域進(jìn)行了匹配，并將片段構(gòu)建報(bào)告基因，驗(yàn)證篩選出的miRNA是否能作用使其熒光活性降低(5)利用miRNA作用位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)研究miRNA對(duì)于PlncRNA

12、-1的影響是否依賴于與miRNA的結(jié)合位點(diǎn)。(6) RNA免疫共沉淀研究PlncRNA-1與miRNA是否直接結(jié)合Ago2，參與RISC復(fù)合物，競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PlncRNA-1是否與AR相互競(jìng)爭(zhēng)。(7)RNA免疫共沉淀研究PlncRNA-1是否與miRNA直接結(jié)合。
　　結(jié)果:(1)生物信息學(xué)分析篩選出13條靶向PlncRNA-1的miRNA。(2)干擾PlncRNA-1后，進(jìn)一步篩選出miR-297-3p和miR-34c-5p為能

13、于PlncRNA-1相互作用的miRNA。(3) miR-297-3p和miR-34c-5p能夠影響AR3'UTR以及PlncRNA-1野生型片段的活性，但不能影響突變掉miRNA結(jié)合位點(diǎn)的PlncRNA-1片段的活性。(4)RNA免疫共沉淀證實(shí)PlncRNA-1與miR-34c-5p以及miR-297-3p直接結(jié)合到Ago2，并且能與AR互相競(jìng)爭(zhēng)。(5)RNA免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)PlncRNA-1與miRNA直接結(jié)合
　　結(jié)論:體

14、外實(shí)驗(yàn)證實(shí)長(zhǎng)鏈非編碼RNA PlncRNA-1能夠上調(diào)AR，miRNA參與PlncRNA-1對(duì)AR的調(diào)控過(guò)程。
　　第四部分 PlncRNA-1促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖，遷移和凋亡抵抗的作用分析
　　方法:(1) CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PlncRNA-1對(duì)于前列腺癌細(xì)胞的增殖影響。凋亡試劑盒檢測(cè)PlncRNA-1對(duì)于前列腺癌細(xì)胞的凋亡影響。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PlncRNA-1對(duì)于前列腺癌細(xì)胞的遷移能力影響。細(xì)胞

15、周期試劑盒檢測(cè)PlncRNA-1對(duì)于前列腺癌細(xì)胞的周期影響。(2)檢測(cè)miR-297-3p以及miR-34c-5p對(duì)于前列腺癌細(xì)胞的增殖，凋亡影響。(3)在LNCaP細(xì)胞中通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)慢病毒(LV-PlncRNA-1)過(guò)表達(dá)PlncRNA-1，以及干擾慢病毒（LV-siPlncRNA-1）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究PlncRNA-1促癌的作用，并且也在22RV1細(xì)胞中檢驗(yàn)。(4)在裸鼠荷瘤上檢測(cè)PlncRNA-1在體內(nèi)對(duì)AR以及相應(yīng)miRNA的影響

16、。
　　結(jié)果:(1) CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒及細(xì)胞周期試劑盒發(fā)現(xiàn)PlncRNA-1能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖。凋亡試劑盒檢測(cè)PlncRNA-1能夠減少前列腺癌細(xì)胞凋亡.Transwell實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼龠M(jìn)前列腺癌細(xì)胞遷移，并且這些效應(yīng)的產(chǎn)生依賴于AR的介導(dǎo)。(2)通過(guò)增殖，凋亡檢測(cè)miR-297-3p以及miR-34c-5p對(duì)前列腺癌細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)其效應(yīng)與PlncRNA-1效應(yīng)相反。(3)在LNCaP細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PlncRNA-1

17、以及干擾PlncRNA-1后，將細(xì)胞荷瘤于裸鼠上發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)PlncRNA-1組與對(duì)照組相比，瘤子體積明顯增大，干擾PlncRNA-1組與對(duì)照組比，瘤子體積明顯減小，同樣效應(yīng)在22RV1細(xì)胞中也有。(4)通過(guò)檢測(cè)荷瘤里面的PlncRNA-1，AR以及相應(yīng)miRNA的變化，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PlncRNA-1后，AR有明顯上調(diào)，miR-297-3p和miR-34c-5p是相應(yīng)下調(diào)的，干擾PlncRNA-1后，AR是明顯下調(diào)的，miR-297-3p

18、和miR-34c-5p是相應(yīng)上調(diào)的。
　　結(jié)論:通過(guò)增殖，凋亡，周期表明PlncRNA-1能為前列腺癌細(xì)胞的癌基因。與其相互作用的miR-297-3p以及miR-34c-5p可能為前列腺癌細(xì)胞的抑癌基因，兩者在體內(nèi)的效應(yīng)也是互相抑制。
　　第五部分 PlncRNA-1相關(guān)基因在前列腺癌臨床病理診斷中的意義研究
　　方法:(1)通過(guò)RT-PCR檢測(cè)16對(duì)前列腺癌組織以及癌旁組織中PlncRNA-1以及相應(yīng)miRNA的表達(dá)

19、。并利用原位雜交驗(yàn)證PlncRNA-1以及相應(yīng)miRNA在前列腺癌組織中的表達(dá)。并通過(guò)RT-PCR檢測(cè)48個(gè)前列腺癌組織中PlncRNA-1相關(guān)基因的表達(dá)(2)通過(guò)RT-PCR檢測(cè)37個(gè)穿刺陽(yáng)性的前列腺癌病人以及35個(gè)穿刺陰性的血里面的PlncRNA-1的含量。
　　結(jié)果:(1)通過(guò)檢測(cè)16對(duì)配對(duì)的癌與癌旁中PlncRNA-1，miR-297-3p，miR-34c-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PlncRNA-1與miR-297-3p以及miR

20、-34c-5p的表達(dá)是呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步檢測(cè)48個(gè)前列腺癌組織中PlncRNA-1，AR，miR-297-3p，miR-34c-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PlncRNA-1與AR是正相關(guān)，與Bcl-xL基因也是正相關(guān)，與miR-297-3p以及miR-34c-5p是負(fù)相關(guān)。(2)通過(guò)檢測(cè)37個(gè)穿刺陽(yáng)性的前列腺癌病人以及35個(gè)穿刺陰性的血里面的PlncRNA-1的含量，發(fā)現(xiàn)穿刺陽(yáng)性PlncRNA-1的含量是明顯高于穿刺陰性的病人。
　　結(jié)論:前