前列腺癌AR復(fù)合體通過(guò)甲基化抑制YAP1的表達(dá).pdf

1、目的：應(yīng)用體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前列腺癌中雄激素受體（AR）對(duì) Yes相關(guān)蛋白1（Yes-associated protein1, YAP1）的調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步探討AR調(diào)節(jié)YAP1的作用機(jī)制。
　　方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法分別檢測(cè)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩種轉(zhuǎn)基因鼠（ AR-wt AR-KO）的YAP1的表達(dá)差異，應(yīng)用蛋白免疫印跡（Western Blotting）的方法分別檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞中抑制AR（使用AR的抑制劑）和激活A(yù)R（過(guò)表達(dá)AR）

2、后YAP1蛋白表達(dá)的變化，應(yīng)用IHC及Western Blotting兩種技術(shù)分別檢測(cè)不同的人前列腺疾病標(biāo)本（BPH、ADPC、CRPC）的 YAP1的表達(dá)差異。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（qPCR）的方法檢測(cè)敲低AR（通過(guò)siRNA）后YAP1及其下游基因的mRNA變化，應(yīng)用Luciferase報(bào)告基因技術(shù)分別檢測(cè)抑制AR（通過(guò)siRNA敲低AR以及使用AR的抑制劑兩種不同的方法）和激活A(yù)R后YAP1的啟動(dòng)子區(qū)活性。應(yīng)用甲基化特異性PCR

3、（MSP）的方法檢測(cè)雄激素依賴的AR對(duì)YAP1啟動(dòng)子區(qū)甲基化的調(diào)節(jié)作用。應(yīng)用蛋白免疫印跡、qPCR和Luciferase報(bào)告基因技術(shù)分析依賴AR的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a(DNMT3a)對(duì)YAP1的調(diào)節(jié)作用。應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ChIP-MSP）驗(yàn)證 DNMT3a、AR對(duì) YAP1的甲基化的調(diào)節(jié)作用。應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)（CoIP）、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP-qPCR）驗(yàn)證AR、DNMT3a、EZH2三者的相互作用及其調(diào)節(jié)YAP1的

4、機(jī)制。
　　結(jié)果：⑴前列腺癌中AR抑制YAP1的表達(dá)。人前列腺組織中，YAP1主要表達(dá)于AR陰性、CK5陽(yáng)性的基底上皮細(xì)胞（basal epithelial cells）的核內(nèi)，而高表達(dá)AR的腔上皮細(xì)胞（luminal cells）則表達(dá)極少量的細(xì)胞內(nèi)彌散分布的YAP1。去勢(shì)抵抗性前列腺癌（ CRPC）中 YAP1的表達(dá)明顯高于激素依賴性前列腺癌（ADPC）。⑵qPCR結(jié)果證實(shí)敲低AR后，YAP1及其下游基因的mRNA上調(diào)。Luc

5、iferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)抑制AR能提高YAP1的啟動(dòng)子區(qū)活性，而雙氫睪酮（DHT）刺激AR能抑制YAP1的啟動(dòng)子區(qū)活性。⑶MSP結(jié)果顯示DHT激活A(yù)R后，YAP1啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化水平上調(diào)，繼而用MDV3100抑制AR活性后，上調(diào)的甲基化回落。⑷DNMT3a在轉(zhuǎn)錄水平抑制YAP1的表達(dá)，這種抑制作用有賴于雄激素激活的AR，同時(shí)AR抑制YAP1的轉(zhuǎn)錄亦依賴DNMT3a，進(jìn)一步的ChIP-MSP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，相比于非甲基化位點(diǎn)，D

6、NMT3a和AR更多地結(jié)合在YAP1的啟動(dòng)子區(qū)甲基化位點(diǎn)。⑸CoIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)AR、DNMT3a、EZH2互相結(jié)合形成復(fù)合體，ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)AR-DNMT3a-EZH2復(fù)合體結(jié)合于YAP1的啟動(dòng)子區(qū)，并且這種結(jié)合是雄激素依賴性的。EZH2的抑制劑 DZNep能抑制復(fù)合體的形成與發(fā)揮作用，相反地，H3K27去甲基化酶抑制劑GSKJ1能促進(jìn)復(fù)合體的形成與發(fā)揮作用。
　　結(jié)論：前列腺組織中，YAP1主要表達(dá)于基底上皮細(xì)胞

7、的核內(nèi)，而腔上皮細(xì)胞則表達(dá)少量的細(xì)胞內(nèi)彌散分布的YAP1。CRPC中YAP1的表達(dá)明顯高于ADPC。前列腺癌中AR能夠抑制YAP1的表達(dá)，并且這種抑制作用依賴于AR與DNMT3a、EZH2相互結(jié)合形成復(fù)合體，此復(fù)合體結(jié)合于YAP1的啟動(dòng)子區(qū)，繼而促進(jìn)YAP1的啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化。CRPC階段，AR、DNMT3a和EZH2對(duì)YAP1的甲基化調(diào)節(jié)過(guò)程明顯抑制，從而導(dǎo)致YAP1高表達(dá)，此過(guò)程對(duì)CRPC階段前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)至關(guān)重要，這