脫氫表雄酮對高脂誘導(dǎo)的兔主動脈及人臍靜脈內(nèi)皮細胞VCAM-1表達的影響.pdf

1、動脈粥樣硬化（Atherosclerosis,AS）是一種慢性炎癥性疾病，細胞因子、黏附分子及趨化因子均參與了AS的病理過程。高脂血癥等各種危險因素可引起動脈管腔內(nèi)皮細胞的功能紊亂，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞表達血管細胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）等細胞因子，從而促使循環(huán)的單核細胞黏附于內(nèi)皮，并遷入內(nèi)皮下間隙，分化成巨噬細胞，巨噬細胞大量攝取脂質(zhì)而最終轉(zhuǎn)化成泡沫細胞，形成早期

2、AS的主要特征。由此可知，黏附分子在AS發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。因此，降低AS相關(guān)細胞黏附分子的表達有可能阻止或減慢AS的發(fā)生。
　　 脫氫表雄酮（Dehydroepiandrosterone,DHEA)是雄激素的前體，少量轉(zhuǎn)化為雌激素。DHEA從出生后分泌不斷增多，至青春期達到頂峰，隨后隨著年齡的增長而不斷下降。DHEA和許多與衰老相關(guān)的疾病有關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)DHEA在抗AS方面也發(fā)揮重要作用。臨床流行病學(xué)研究顯示，動脈

3、粥樣硬化以及由此引發(fā)的心、腦血管疾病與血漿中低水平的DHEA有著密切的關(guān)系。DHEA在體內(nèi)主要是在細胞內(nèi)細胞色素P450芳香酶的作用下降解成雌酮而發(fā)揮作用。由此可以推想，增加細胞內(nèi)細胞色素P450芳香酶的活性，應(yīng)該可以特異性地加強DHEA在血管局部發(fā)揮抗AS作用。研究表明，細胞色素P450芳香酶具有多個啟動子，在內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞中主要由啟動子Ⅰ.6發(fā)揮作用，維甲酸受體被激活后可通過Ⅰ.6啟動子增強細胞色素P450芳香酶的表達。因此，

4、補充維甲酸受體激活物--全反式維甲酸應(yīng)該可以增強細胞內(nèi)雌激素水平，從而特異性的增強DHEA的抗AS作用。本實驗從體外、體內(nèi)兩個水平進行研究。體外實驗以ox-LDL作為刺激因素，體內(nèi)實驗以高脂造成AS的動物模型。DHEA、全反式維甲酸作為干預(yù)因素,VCAM-1作為檢測指標,旨在探討DHEA抗AS的機制。
　　 第一部分：脫氫表雄酮對高脂誘導(dǎo)的兔主動脈VCAM-1表達的影響
　　 目的：
　　 探討脫氫表雄酮對高脂誘

5、導(dǎo)的兔主動脈VCAM-1表達的影響，以及全反式維甲酸在這一過程中的作用。
　　 方法：
　　 一、AS及治療組模型的復(fù)制
　　 40只正常成年雄性新西蘭大耳白兔，體重2.0-2.5kg。隨機分5組，每組8只，分籠喂養(yǎng)。(1)正常對照組：喂飼正常飼料。(2)高脂模型組：喂飼高脂飼料（含1％膽固醇、3％豬油的飼料）。(3)高脂＋DHEA組：喂飼加入DHEA(0.125g/kg﹒d)的高脂飼料。(4)高脂＋DHEA＋全

6、反式維甲酸組：喂飼加入DHEA(0.125g/kg﹒d)和全反式維甲酸（0.6mg/kg﹒d）的高脂飼料。(5)單DHEA組：喂飼加入DHEA（0.125g/kg﹒d)的正常飼料。各組白兔均喂養(yǎng)60天。實驗周期結(jié)束后，各組大耳白兔用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉（1.3ml/kg）。固定后，迅速打開胸腔心臟采血，之后取心臟至腎動脈分支的主動脈。從主動脈弓處取一小塊血管，放入－80℃冰箱，留做RT-PCR之用。將剩下的血管放入4％多聚甲醛中固

7、定。
　　 二、血脂的生化檢測
　　 將所采血液用全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇（TC）、總甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的含量。
　　 三、斑塊面積與總面積比、內(nèi)膜中膜比的測定
　　 將固定好的血管脫水、石蠟包埋、切片，做內(nèi)彈力板染色。采用HMIAS-2000高清晰度圖像處理系統(tǒng)分析斑塊面積與總面積比、內(nèi)膜中膜比。
　　 四、免疫組織化學(xué)

8、
　　 將固定好的血管脫水、石蠟包埋、切片，采用SP法，用兔抗兔VCAM-1多克隆抗體和相應(yīng)的免疫組織化學(xué)檢測試劑盒進行免疫組織化學(xué)染色，一抗1：400稀釋，二抗1：1稀釋，其余步驟按常規(guī)方法進行。用細胞胞漿內(nèi)和胞膜上棕黃色陽性顆粒的平均吸光度值（A）表示其VCAM-1蛋白表達量。
　　 五、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈(RT-PCR)反應(yīng)
　　 用Trizol一步法提取各組主動脈的RNA，將各組RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA。取c

9、DNA產(chǎn)物進行PCR循環(huán)。最后所得反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色。繼用SQ9636型掃描系統(tǒng)掃描，HMIAS-2000型圖像分析系統(tǒng)檢測各組目的基因及內(nèi)參的積分吸光度值 (A)，并以兩者比值作為各組mRNA的相對表達量。
　　 六、統(tǒng)計學(xué)方法
　　 所有實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 12.0軟件處理，主要統(tǒng)計指標進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布的各個統(tǒng)計指標均以均數(shù)標準差（±s）表示。多組間統(tǒng)計學(xué)差異顯著性采用單因素方

10、差分析（ANOVA）,組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05表示統(tǒng)計學(xué)上有差異，P<0.01有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 一、血脂檢測的結(jié)果顯示：
　　 TC和LDL-C的含量：高脂組高于正常對照組（P<0.05）；高脂+DHEA＋全反式維甲酸組低于高脂組（P<0.05）；單DHEA組與正常對照組無顯著性差異（P>0.05）。而TG和HDL-C的含量：各組均無顯著性差異。
　　 二、斑塊面積與總面積比

11、、內(nèi)膜中膜比測定結(jié)果顯示：
　　 各組斑塊面積與總面積比及內(nèi)膜中膜比高脂組大于正常對照組（P<0.05）;高脂+DHEA組小于高脂組（P<0.05）；高脂+DHEA+全反式維甲酸組與高脂+DHEA組相比無顯著性差異；單DHEA組與正常對照組相比無顯著性差異。
　　 三、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：
　　 陽性信號為細胞胞漿內(nèi)和胞膜上棕黃色顆粒。與正常對照組相比高脂組的VCAM-1蛋白表達明顯增強(P<0.01)，表現(xiàn)為

12、棕黃色顆粒明顯增多，顏色明顯加深。同高脂組比較高脂＋DHEA組VCAM-1蛋白表達受到抑制(P<0.01)，表現(xiàn)為顆粒減少、顏色變淺。高脂+DHEA+全反式維甲酸組與高脂＋DHEA組相比VCAM-1蛋白量無顯著差異(P>0.05)。單DHEA組與正常對照組相比VCAM-1蛋白量也無顯著差異(P>0.05)。
　　 四、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的結(jié)果顯示：
　　 各組主動脈均表達VCAM-1 mRNA，高脂組表達

13、的mRNA明顯高于正常對照組（P<0.05），同高脂組比較，高脂＋DHEA組mRNA表達顯著降低（P<0.05）。而高脂＋DHEA＋全反式維甲酸組與高脂＋DHEA組表達mRNA無差異(P>0.05)。單DHEA組與正常對照組表達mRNA無差異。
　　 結(jié)論：
　　 DHEA能夠特異性的抑制高脂誘導(dǎo)的兔主動脈動脈粥樣硬化斑塊形成及VCAM-1的表達。DHEA抑制VCAM-1的表達可能是其抗動脈粥樣硬化的機制之一。而全反式維

14、甲酸對DHEA的這一作用并無明顯增強。
　　 第二部分：脫氫表雄酮對ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞VCAM-1表達的影響
　　 目的：
　　 探討脫氫表雄酮對ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞VCAM-1表達的影響，以及全反式維甲酸在這一過程中的作用。
　　 方法：
　　 一、人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)與分組
　　 用胰酶消化法獲取人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical veno

15、us endothelial cells,HUVEC）。培養(yǎng)于M199培養(yǎng)基，內(nèi)含15％FBS,0.03％谷氨酰胺,50μg/ml ECGS。待細胞長至融合狀態(tài)，用0.1%胰酶消化傳代。將生長良好的內(nèi)皮細胞隨機分為6組：
　　 1.正常對照組：培養(yǎng)基中不加任何刺激因素；
　　 2.ox-LDL組：培養(yǎng)基中加25mg/L ox-LDL；
　　 3.ox-LDL＋DHEA(低濃度)組：培養(yǎng)基中加25mg/L ox-L

16、DL和100nmol/L DHEA；
　　 4.ox-LDL＋DHEA(高濃度)組：培養(yǎng)基中加25mg/L ox-LDL和1000nmol/L DHEA；
　　 5.ox-LDL＋DHEA＋全反式維甲酸組：培養(yǎng)基中加25mg/L ox-LDL、1000nmol/L DHEA和10-8mol/L全反式維甲酸
　　 6.DHEA組：培養(yǎng)基中加1000nmol/L DHEA；
　　 以上各組均用相應(yīng)藥物作用24

17、小時。
　　 二、酶聯(lián)免疫吸附法
　　 將生長良好的HUVEC分組加藥,作用24h,換常規(guī)培養(yǎng)基,12h后,收集各組培養(yǎng)基。3000r/min,離心20min，收集各組上清。用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)定量試劑盒測定HUVEC分泌至培養(yǎng)基中VCAM-1蛋白的含量。操作嚴格按試劑盒說明書進行,實驗結(jié)果在492nm波長讀取吸光度值,并根據(jù)標準曲線計算培養(yǎng)基

18、中VCAM-1蛋白的含量。
　　 三、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈(RT-PCR)反應(yīng)
　　 用Trizol一步法提取各組HUVEC的RNA，將各組RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA。取cDNA產(chǎn)物進行PCR循環(huán)。最后所得擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,GoldView染色，繼用SQ9636型掃描系統(tǒng)掃描。HMIAS-2000型圖像分析系統(tǒng)檢測各組目的基因及內(nèi)參的積分吸光度值 (A),并以兩者比值作為各組mRNA的相對表達量。
　　 結(jié)論：