表達(dá)人CD4分子的小鼠白血病細(xì)胞系的建立及其細(xì)胞周期研究.pdf

1、近年來分子生物學(xué)發(fā)展迅速，基因轉(zhuǎn)染已經(jīng)廣泛用于多種實(shí)驗(yàn)方法和治療方法中。為了讓小鼠白血病細(xì)胞表達(dá)特定抗原分子作為腫瘤特異性抗原(TSA)，我們選用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將目的基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)工作，共分為兩部分。 實(shí)驗(yàn)一表達(dá)人CD4基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建 目的：構(gòu)建高效穩(wěn)定表達(dá)人CD4(hCD4)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，使hCD4分子能穩(wěn)定持久表達(dá)于靶細(xì)胞。 方法：利用PCR技術(shù)大量擴(kuò)增hCD4cDNA的目的基因

2、，并引入酶切位點(diǎn)中，用連接酶將目的基因與載體pLXIN相連接，隨后轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，PCR鑒定出正確轉(zhuǎn)染的陽性菌落，經(jīng)酶切及測(cè)序證實(shí)hCD4目的基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入載體(稱為pLXIN-hCD4質(zhì)粒)后，再用脂質(zhì)體法將質(zhì)粒pLXIN-hCD4轉(zhuǎn)染到PT67包裝細(xì)胞，經(jīng)藥物篩選出抗性克隆并擴(kuò)增建系，收集含病毒顆粒的上清液以感染靶細(xì)胞。 結(jié)果：PCR菌落鑒定及酶切鑒定顯示hCD4基因成功地插入pLXIN載體中，經(jīng)測(cè)序與gene

3、bank中的序列完全一致。質(zhì)粒pLXIN-hCD4轉(zhuǎn)染成功的PT67細(xì)胞可以抵抗G418生長(zhǎng)，將抗性細(xì)胞克隆挑出培養(yǎng)，得到穩(wěn)定產(chǎn)生病毒顆粒的PT67細(xì)胞(為hCD4-PT67細(xì)胞)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了能表達(dá)hCD4基因的重組質(zhì)粒pLXIN-hCD4。 實(shí)驗(yàn)二表達(dá)人CD4分子的L615細(xì)胞的獲得及其細(xì)胞周期研究 目的：研究hCD4-PT67細(xì)胞產(chǎn)生的病毒顆粒感染小鼠T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系L615后(感染后稱為

4、L615-hCD4細(xì)胞)，L615-hCD4細(xì)胞表達(dá)hCD4分子的情況，以及該細(xì)胞的細(xì)胞周期。 方法：收集hCD4-PT67細(xì)胞含病毒顆粒的上清液感染L615細(xì)胞，用G418篩選出感染成功的細(xì)胞，擴(kuò)增后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)L615-hCD4細(xì)胞表達(dá)hCD4分子的情況。并用PI-FCM法檢測(cè)L615細(xì)胞和L615-hCD4細(xì)胞的細(xì)胞周期。 結(jié)果：感染所獲得的L615-hCD4細(xì)胞高度表達(dá)hCD4分子，反復(fù)傳代后hCD4分子仍