心肌營(yíng)養(yǎng)素對(duì)阿爾茨海默癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、心肌營(yíng)養(yǎng)素對(duì)阿爾茨海默癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的作用及機(jī)制研究
　　 背景：心肌營(yíng)養(yǎng)素（Cardiotrophin-1，CTF1）作為一種多效細(xì)胞因子，抗凋亡、抗氧化，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，并且可以延緩運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)退行性疾病進(jìn)程。中樞神經(jīng)組織表達(dá)分泌CTF1，但CTF1對(duì)中樞神經(jīng)退行性疾病的作用及機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建腦組織特異的CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠，研究該基因?qū)PPswe/PS1dE9阿爾茨海默癥的作用以及機(jī)制研究。

2、　　 方法：免疫印跡和組織化學(xué)檢測(cè)CTF1在野生型C57BL/6J小鼠和APPswe/PS1dE9阿爾茨海默癥模型小鼠腦組織中時(shí)程表達(dá)變化。腦組織特異的高表達(dá)CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠與APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠雜交獲得雙轉(zhuǎn)基因小鼠。開(kāi)放曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察WT、APPswe/PS1dE9、CTF1及CTF1×APPswe/P1S1dE9小鼠自主活動(dòng)的改變，Morris水迷宮檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。硫磺素-S熒光染色觀察老年斑的改變。PET-

3、CT觀察葡萄糖攝取情況。Westernblotting檢測(cè)WT、APPswe/PSldE9、CTF1及CTF1×APPswe/PS1dE9小鼠腦組織CTF1信號(hào)分子ERK1/2、Akt、、JAK/Stat3的表達(dá)水平以及GSK3β下游靶分子葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.1(GLUT-1)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3(GLUT-3)的表達(dá)。重組人CTF1刺激SH-SY5Y細(xì)胞，Westernblotting檢測(cè)GSK3β和GLUT-3的表達(dá)變化。使用GSK3p

4、和GLUT-3抑制劑檢測(cè)CTF1刺激SH-SY5Y后葡萄糖攝取。透射電鏡分析海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變。雙向凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)分離WT、APPswe/PS1dE9、CTF1及CTF1×APPswe/PS1dE9小鼠腦組織蛋白，免疫印跡檢測(cè)腦組織線粒體電壓依賴性陰離子通道蛋白質(zhì)(voltage-dependentanionchannel，VDAC)的磷酸化水平。分離WT、A

5、PPswe/PS1dE9、CTF1及CTF1×APPswe/PS1dE9小鼠腦組織中線粒體，Westernblotting檢測(cè)己糖激酶I(Hexokinase，HKI)和細(xì)胞色素c(Cytochromec，Cytc)的分布改變。
　　 結(jié)果:免疫印跡結(jié)合免疫組化結(jié)果顯示，野生小鼠CTF1的表達(dá)水平隨著月齡的增加表達(dá)逐漸減少；與同月齡野生小鼠相比,3、6、9月齡APPswe/PS1dE9阿爾茨海默癥模型小鼠腦組織中CTF1表達(dá)下調(diào)

6、。建立腦組織特異的CTF1×APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)小鼠，6月齡小鼠行為學(xué)結(jié)果顯示，開(kāi)放曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中與同月齡野生小鼠相比，APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠自主活動(dòng)增加（垂直方向增加54％，水平方向增加了27.4％），趨觸性減少（中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間增加了1倍），不活躍、活躍和高度活躍頻次以及活躍變換總頻次均增加。與APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠相比，CTF1×APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)小鼠自主活動(dòng)減少（垂直方向減少了12％

7、，水平方向減少了17.9％），趨觸性增加（中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間減少了46.2％），不活躍、活躍和高度活躍頻次以及活躍變換總頻次均減少。Morris水迷宮平臺(tái)隱藏實(shí)驗(yàn)中，CTFI×APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)小鼠較之APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠尋找平臺(tái)時(shí)間縮短；在空間探索實(shí)驗(yàn)中CTF1×APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間增加了41.4％，穿越目標(biāo)象限的頻次增加了47.9％。硫磺素.S熒光染色發(fā)現(xiàn)CTF1×APPsw

8、e/PS1dE9雙轉(zhuǎn)小鼠海馬老年斑數(shù)量以及面積減少了35.8％和18.2％，皮層的老年斑數(shù)量以及面積減少了41.9％和26.9％。PET觀察腦組織葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生對(duì)照小鼠相比，APPswe/PSldE9轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織額葉葡萄糖攝取減少了38.3％，顳葉減少了46.4％，海馬減少了44.8％；與APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠相比，CTF1×APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)小鼠額葉葡萄糖攝取增加了了37.7％，顳葉增加了

9、50.8％，海馬增加了53.2％。APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中P-GSK-3p和GLUT-3水平相對(duì)于野生小鼠顯著下降，而在CTF1×APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)小鼠中P-GSK-3β和GLUT-3表達(dá)水平均升高。重組hCTF1刺激細(xì)胞后，P-GSK-3β和GLUT-3的表達(dá)水平上調(diào)，葡萄糖攝取增加。GSK-3β和GLUT-3受到抑制后可以逆轉(zhuǎn)hCTF1引起SH-SY5Y細(xì)胞葡萄糖攝取的增加。電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察到APPs

10、we/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞體中線粒體腫脹，嵴斷裂，神經(jīng)突里的線粒體電子密度升高，神經(jīng)突里的軸絲未見(jiàn)異常，而CTF1轉(zhuǎn)基因可以緩解APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元線粒體的結(jié)構(gòu)異常。2-DE結(jié)合免疫印跡顯示APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織線粒體中VDAC蘇氨酸磷酸化水平升高，而CTF1及CTF1×APPswe/PS1dE9小鼠腦組織中VDAC蘇氨酸磷酸化水平下調(diào)。與WT小鼠相比，APPswe/PS1

11、dE9轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元線粒體中HKI和Cytc釋放到胞漿，引起胞漿中HKI和Cytc含量升高；與APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠相比，CTF1×APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)小鼠神經(jīng)元胞漿中HKI和Cytc含量降低，線粒體中含量恢復(fù)至正常水平。
　　 結(jié)論:CTF1轉(zhuǎn)基因可明顯改善APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠異常的自主活動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶能力損傷。CTF1抑制腦組織GSK-3β活性，上調(diào)GLUT-3表達(dá)升高，增加葡萄糖攝取

12、；通過(guò)抑制GSK-3β活性，抑制VDAC磷酸化引起線粒體mPTP的過(guò)度開(kāi)放，減少Cytc的釋放，緩解線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常，改善阿爾茨海默癥的能量代謝障礙。因此，CTF1有望成為治療阿爾茨海默癥的候選營(yíng)養(yǎng)因子。
　　 第二部分、柚皮苷對(duì)阿爾茨海默癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的治療作用及機(jī)制究
　　 背景：柚皮苷Naringin具有的神經(jīng)保護(hù)作用，可以延緩神經(jīng)退行性疾病進(jìn)程。然而關(guān)于柚皮苷對(duì)中樞神經(jīng)疾病的作用研究都集中在其抗氧化能力上，

13、對(duì)其它機(jī)制及潛在的治療作用未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用APPswe/PS1dE9阿爾茨海默癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型，多個(gè)層次研究其藥理作用并進(jìn)行機(jī)制的研究。
　　 方法：APPswe／PS1dE9轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠隨機(jī)分組，每組12只，雌雄各半，并選擇12只野生鼠作為對(duì)照組，這些小鼠在性別、體重相匹配，將模型小鼠分為4組：AD安慰劑組、安理申治療組(2mg／kg／d)、柚皮苷治療組(50mg／kg／d)、柚皮苷治療組(100mg／kg／d)。安

14、慰劑組及對(duì)照組小鼠給予常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)鼠糧，安理申治療組和柚皮苷治療組在常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)鼠糧中加入相應(yīng)劑量的藥物，小鼠每天鼠糧的攝入量按下列計(jì)算：每只體重為209的小鼠，每天攝入鼠糧為39，選擇3月齡小鼠給藥，治療時(shí)間為16周，給藥后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)老年斑變化，PET觀察葡萄糖攝取情況，免疫印跡檢測(cè)腦組織p-GSK-3p，p-CaMKⅡ，p-AMPA的表達(dá)。免疫印跡檢測(cè)腦組織COX-2，iNOS的表達(dá)；LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)

15、，免疫印跡檢測(cè)Naringin對(duì)COX-2，iNOS的抑制作用。
　　 結(jié)果：行為學(xué)實(shí)驗(yàn)開(kāi)放曠場(chǎng)中，APPswe/PS1dE9小鼠趨觸性減少，不活躍、活躍和高度活躍頻次以及活躍變換總頻次增加。與APPswe／PS1dE9小鼠相比，柚皮苷治療組(Naringin50和Naringin100)小鼠趨觸性增加，不活躍、活躍和高度活躍頻次以及活躍變換總頻次減少。與APPswe/PS1dE9小鼠相比，避暗實(shí)驗(yàn)中，Naringin100治療

16、小鼠進(jìn)入暗室潛伏期延長(zhǎng)94.6％，錯(cuò)誤次數(shù)減少59.2％。Morris水迷宮平臺(tái)隱藏實(shí)驗(yàn)中，Nafingin100小鼠尋找平臺(tái)時(shí)間縮短；在空間探索實(shí)驗(yàn)中穿越目標(biāo)象限的頻次增加了60.7％。硫磺素-S熒光染色發(fā)現(xiàn)Naringin100治療小鼠海馬老年斑數(shù)量減少26.4％，老年斑面積減少32.9％。PET觀察腦組織葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，APPswe/PS1dE9阿爾茨海默癥轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織額葉葡萄糖攝取減少了38％，顳葉減少了44％，海馬

17、減少了41％；Naringin100治療小鼠額葉葡萄糖攝取增加了72.5％，顳葉增加了61％，海馬增加了62％。APPswe伊S1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中P-GSK-3p，P-CaMKⅡ，P-AMPA水平相對(duì)于野生小鼠顯著下降，而Naringin100治療小鼠P-GSK-3B，P-CaMKⅡ，P-AMPA水平表達(dá)水平均升高。在體外Naringin100可以抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子COX-2，iNOS的表達(dá)，而在體內(nèi)Naringin100

18、并不能抑制APPswe／PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中活化的炎癥因子。
　　 結(jié)論：Naringin抑制腦組織GSK-3β活性，減少老年斑，緩解糖攝取障礙；活化CaMKⅡ改善長(zhǎng)時(shí)程記憶，進(jìn)而調(diào)節(jié)改善阿爾茨海默癥的病理發(fā)展，明顯改善APPswe／PS1dE9異常的自主活動(dòng)以及認(rèn)知功能障礙。因此，Naringin有可能成為治療阿爾茨海默癥的候選中藥單體。
　　 第三部分、柚皮苷與吳茱萸堿聯(lián)合用藥對(duì)阿爾茨海默癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型學(xué)

19、習(xí)記憶能力的影響
　　 背景：炎癥以及氧化應(yīng)激在阿爾茨海默氏癥疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，中藥單體吳茱萸堿(Evodiamine)具有較強(qiáng)的抗炎作用，而柚皮苷(Naringin)則具有較強(qiáng)的抗氧化特性和改善線粒體功能障礙的作用，本實(shí)驗(yàn)采用柚皮苷與吳茱萸堿聯(lián)合用藥對(duì)APPswe／PS1dE9轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，探討柚皮苷與吳茱萸堿聯(lián)合用藥是否具有協(xié)同作用。
　　 方法：APPswe／PS1dE9轉(zhuǎn)基

20、因癡呆模型小鼠隨機(jī)分組，每組12只，雌雄各半，并選擇12只野生鼠作為對(duì)照組，這些小鼠在性別、體重相匹配，選擇在3月齡開(kāi)始進(jìn)行治療，給藥16周后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，以安理申作為陽(yáng)性藥對(duì)照，并與安慰劑組小鼠進(jìn)行比較，各給藥組按設(shè)定劑量分別單獨(dú)或聯(lián)合加入鼠糧中。
　　 結(jié)果：給藥16周后，單獨(dú)使用柚皮苷和吳茱萸堿縮短尋找平臺(tái)的潛伏期分別為32％和10％。柚皮苷與吳茱萸堿聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著縮短尋找平臺(tái)的潛伏期47％。
　　 結(jié)論：?jiǎn)为?dú)