阿爾茨海默氏病轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建及相關(guān)研究.pdf

1、【目的】阿爾茨海默氏病(Alzheimer's Disease,AD)是一種隨著世界人口年齡的增長而遞增的神經(jīng)退行性紊亂。導(dǎo)入早老素1(presenilin 1,PS1)的動物模型能表現(xiàn)出與人類AD患者相似的病理特征。為進(jìn)一步闡明AD的發(fā)病機理及為治療AD提供動物模型,本研究擬構(gòu)建國內(nèi)首例人類PS1突變型(PS1AE9)轉(zhuǎn)基因小鼠,并對其進(jìn)行一系列鑒定。為了進(jìn)一步探索AD治療的新方法,我們將TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related

2、 apoptosis inducing ligand,TRAIL)基因注入正常昆明白小鼠第四腦室,檢測一系列基因表達(dá)水平的變化并初步觀察其安全性。 【方法】用顯微注射的方法將PrP-PSlAE9片斷注入C57(♀)和DBA(♂)雜合受精卵的雄原核中。采用PCR、Southem Blot、RT-PCR、Real-Time PCR、Western Blot、免疫組化、H/E染色和行為學(xué)方法檢測轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。另外從人類基因組中克隆

3、trail基因,構(gòu)建質(zhì)粒pAAV-TRAIL,注射到昆明白小鼠第四腦室,采用RT-PCR和H/E染色檢測一系列基因的表達(dá)水平和大腦病理情況。 【結(jié)果】顯微注射后受精卵的完整率、幼仔的出生率和外源基因的整合率分別為79.59[％]、7.44[％]和1.03[％];通過PCR和Southem雜交成功檢測出4只PrP-PS1AE9轉(zhuǎn)基因陽性小鼠;RT-PCR和Real-TimePCR結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因陽性鼠的大腦中表達(dá)人psl基因;W

4、estern雜交結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因陽性鼠的大腦中。PSl蛋白的表達(dá)量高于野生型小鼠;免疫組化結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因陽性鼠的大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞胞漿中高表達(dá)PS1蛋白,而在野生型小鼠的大腦的皮質(zhì)區(qū)僅見神經(jīng)細(xì)胞胞漿有較弱PSI染色;H/E染色結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因陽性鼠的大腦結(jié)構(gòu)非正常,神經(jīng)纖維溶解,膠質(zhì)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增生,神經(jīng)細(xì)胞變性腫脹或壞死,并出現(xiàn)噬神經(jīng)現(xiàn)象,而野生型小鼠的大腦海馬和皮質(zhì)區(qū)的結(jié)構(gòu)基本正常;行為學(xué)分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因鼠及其F1代學(xué)習(xí)

5、和記憶能力均低于野生型。hTRAIL注射后未見小鼠腦組織出現(xiàn)病理變化,RT-PCR結(jié)果顯示BDNF、NT4、CD11b、CD11c、Nestin、SOX1、CNTF及GDNF的mRNA表達(dá)升高。 【結(jié)論】本實驗采用顯微注射的方法成功構(gòu)建了PrP-PS1 E9轉(zhuǎn)基因陽性小鼠,轉(zhuǎn)基因小鼠腦中表達(dá)人類psl基因及其所編碼的蛋白,具有與人類阿爾茨海默氏病相似的病理及行為學(xué)改變。hTRAIL注射后未見引起腦內(nèi)病理改變，同時可能誘導(dǎo)小鼠腦組