miR-206在組織中的分布和成肌分化過程中的表達(dá)及生物學(xué)作用的初步研究.pdf

1、各種創(chuàng)傷如車禍傷、槍彈傷、燒傷及部份內(nèi)科疾病如糖尿病、腫瘤和癱瘓所致的肢體壞疽都常伴肌組織損傷，對于嚴(yán)重或面積較大的肌損傷或缺損，肌肉的再生相對困難，創(chuàng)面最終被纖維結(jié)締組織替代而形成瘢痕，導(dǎo)致機(jī)體運(yùn)動功能障礙并累及神經(jīng)、血管系統(tǒng)，影響患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。因此，如何促進(jìn)大面積肌肉缺損后的修復(fù)，調(diào)控肌細(xì)胞分化的過程和其中的調(diào)控機(jī)制一直是創(chuàng)傷修復(fù)研究的熱點(diǎn)問題之一。 MicroRNA(miRNA)是一類長度為21～23核苷酸(nt)

2、的高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，它們一般通過Dicer酶從具有發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)的前體RNA加工而來，在生長發(fā)育、增殖分化、腫瘤發(fā)生和病毒感染等多種生物學(xué)事件中發(fā)揮了重要作用。以往，人們注意力主要集中于傳統(tǒng)的與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的三種RNA(mRNA、tRNA和r RNA)的研究，自從小RNA(主要包括miRNA和siRNA兩類)被發(fā)現(xiàn)之后，已經(jīng)從人類和線蟲體內(nèi)分別鑒定數(shù)百種miRNA，對擬南芥等植物基因組分析結(jié)果表明，miRNA大部分都作用

3、于與發(fā)育過程相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，尤其與表型建立和細(xì)胞分化有關(guān)。miR-206最初是在從人和小鼠肌肉組織中克隆鑒定出來，長度為22nt，由73nt的莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體剪切加工成熟，其編碼基因定位于6號染色體，與miR-133簇集分布，核心序列與miR-1一致，基因芯片檢測提示miR-206在骨骼肌細(xì)胞分化成熟過程中表達(dá)呈現(xiàn)一定的時(shí)空特異性，這提示miR-206可能具有同miR-133和miR-1相關(guān)的促成肌分化功能，但其具體的生物學(xué)功能還未見詳細(xì)報(bào)

4、道。因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們首先檢測了miR-206在C57小鼠各組織臟器中的表達(dá)情況；然后利用C2C12細(xì)胞模擬體外成肌分化過程，觀測miR-206在成肌分化過程中的表達(dá)變化；克隆構(gòu)建miR-206的腺病毒表達(dá)載體和合成化學(xué)修飾反義鏈，轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，使其在細(xì)胞中過表達(dá)或者抑制其表達(dá)的情況下，觀察對細(xì)胞成肌分化的影響，明確其生物學(xué)功能。主要的結(jié)果如下： 1．miR-206在C57小鼠的骨骼肌和心肌中呈強(qiáng)陽性表

5、達(dá)，小腸、脾臟、肺臟組織有少量表達(dá)，腦、腎臟、肝臟組織未見陽性表達(dá)，表明miR-206的分布具有組織特異性。 2．利用C2C12細(xì)胞在體外成功誘導(dǎo)其向成肌細(xì)胞分化，通過形態(tài)學(xué)觀察，RT-PCR、western-blot、細(xì)胞免疫熒光組織化學(xué)及流式細(xì)胞儀等方法進(jìn)行檢測，證實(shí)我們所建立的細(xì)胞分化模型是成功的，并觀察到隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，miR-206在成肌分化過程中表達(dá)量逐漸增高的，表達(dá)改變具有階段特異性。 3．成功克隆了

6、miR-206基因并構(gòu)建到腺病毒表達(dá)載體中。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出mi-206基因片段，通過T-A克隆連接至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中，然后轉(zhuǎn)化含骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，通過同源重組產(chǎn)生腺病毒載體質(zhì)粒pAdEasy/miR-206，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后包裝出重組病毒載體Adv/mir-206病毒。提取轉(zhuǎn)染后的293細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，可成功擴(kuò)增出354bp的目的片段，Northem-blot

7、顯示轉(zhuǎn)染后293細(xì)胞miR-206呈陽性表達(dá)。 4．miR-206的生物學(xué)功能的初步觀察：將Adv/miR-206轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，使其高表達(dá)miR-206，在未加入誘導(dǎo)劑的情況下，可見C2C12細(xì)胞向成肌細(xì)胞分化，有粗大多核的肌管形成，肌特異性相關(guān)蛋白MHC表達(dá)增加，而Adv/GFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組則沒有此類變化，說明在無誘導(dǎo)劑的情況下，提高miR-206在C2C12細(xì)胞的表達(dá)水平也可以促進(jìn)細(xì)胞向成肌方向分化。利用反義核酸技術(shù)將

8、miR-206反義鏈導(dǎo)入C2C12細(xì)胞后，再加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)分化，其結(jié)果顯示導(dǎo)入反義鏈的C2C12細(xì)胞在加入誘導(dǎo)劑的情況下，向成肌分化的能力明顯減弱，誘導(dǎo)分化第2天計(jì)數(shù)胞體比C2C12細(xì)胞伸長2倍以上的細(xì)胞數(shù)比率，可見反義鏈轉(zhuǎn)染組為35％，而正常細(xì)胞誘導(dǎo)組為87％，說明在有誘導(dǎo)劑的情況下，阻斷了miR-206在C2C12細(xì)胞的表達(dá)可明顯降低C2C12向成肌方向分化的能力。因此，我們認(rèn)為miR-206是參與成肌分化并且維持這種分化狀態(tài)的

9、一個關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子。 5．對Adv/miR-206轉(zhuǎn)染后的C2C12細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)Adv/mi206轉(zhuǎn)染能夠促使C2C12的S期細(xì)胞比例明顯下降，退出細(xì)胞分裂周期，以利于其進(jìn)入分化狀態(tài)，而Adv/GFP空載體轉(zhuǎn)染組C2C12細(xì)胞周期改變不明顯：Adv/miR-206轉(zhuǎn)染至MSC可見細(xì)胞形態(tài)伸長，雙核細(xì)胞比例明顯增加。由此，推測提高miR-206的表達(dá)可能模擬了發(fā)育過程中的某些信號，通過作用于細(xì)胞周期蛋白等因子，促使