RNAi抑制Tctex5在雄性鼠生殖細(xì)胞中的表達(dá)及意義.pdf

1、全世界范圍內(nèi)，人類不育影響著大約10％～15％的夫婦。不育的原因夫婦雙方各占一半【1】【2】【3】。臨床上>40％的男性不育患者原因不清，并且常伴有無精或少精癥[4]。更令人擔(dān)憂的是因為環(huán)境污染和化學(xué)制劑使得人類精子的質(zhì)量正在減少，并認(rèn)為引起基因突變【5】【6】。男性生殖功能障礙與生殖相關(guān)基因突變的研究是目前生殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一【7】。Tctex5（Expression of T-complex testis expressed 5）

2、基因是在老鼠的精子中發(fā)現(xiàn)的一種新型的酶調(diào)節(jié)因子，主要在老鼠的睪丸和精子中豐富表達(dá)。Tctex5基因在精子發(fā)生中的調(diào)控機(jī)制研究，國內(nèi)尚未見報導(dǎo)。Tctex5基因在人類稱作Ppp1r11，即蛋白質(zhì)磷酸酶1亞調(diào)節(jié)單位11(protein phosphatase-1 inhibitor-3)。Ppp1r11在睪丸中的潛在角色尚不清楚。Ppp1r1編碼一種特異的蛋白質(zhì)磷酸1（PP1）抑制劑：絲氨酸/蘇氨酸磷酸。Ppp1r1作為一個未知功能的基因，

3、可能參與了精子發(fā)生過程的調(diào)控。
　　RNAi通過相應(yīng)的dsRNA特異地降調(diào)同源mRNA，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默，這一技術(shù)已成功應(yīng)用于對未知功能基因的的研究。dsRNA能通過RNAi機(jī)制介導(dǎo)同源基因的沉默，RNAi是一種進(jìn)化上保守機(jī)制，一個階梯式的過程，通過RNaseⅢ樣活性的核酸酶（Dicer酶）在體內(nèi)產(chǎn)生有活性的小干擾RNA（siRNA）。siRNA有一個特征結(jié)構(gòu)：兩條單連末端為5’端磷酸和3’端羥基，此外每條單鏈的3’端均有2

4、～3個突出的非配對堿基，21-23nt的siRNA能降調(diào)同源RNA。RNAi已被廣泛應(yīng)用于基因功能的研究，包括在果蠅、線蟲、錐蟲、小鼠及哺乳動物中相繼發(fā)現(xiàn)存在RNAi現(xiàn)象。
　　本研究旨在設(shè)計并獲得能夠特異下調(diào)基因表達(dá)的小干擾RNA，并檢測所獲得的siRNA能否引起雄性鼠生殖細(xì)胞中Tctex5基因的沉默。為研究Ppp1r11的功能和產(chǎn)生特異轉(zhuǎn)錄基因敲除的小鼠提供技術(shù)手段，對進(jìn)一步了解Ppp1r11在精子發(fā)生過程中的潛在作用具有重要

5、意義。盡管Tctex5基因的調(diào)控機(jī)制目前還不清楚。但對于進(jìn)一步了解精子發(fā)生的分子和細(xì)胞機(jī)理，對于發(fā)育生物學(xué)、生命起源及生育控制具有重要的意義。
　　目的：以Ppp1r11基因為靶基因，采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)特異性地抑制CRL-1715、CRL－2053、CRL-2196細(xì)胞中Ppp1r11的表達(dá)。
　　方法：針對Ppp1r11基因設(shè)計一段小干擾RNA(siRNA)，由Ambion公司化學(xué)合成，用脂質(zhì)體siPORTTT

6、MNeoFXTM轉(zhuǎn)染試劑盒將該siRNA轉(zhuǎn)染CRL-1715、CRL－2053、CRL-2196三種細(xì)胞，采用RT-PCR和Westernblot分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測該siRNA對表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：針對Ppp1r11的siRNA能夠明顯下調(diào)CRL-1715、CRL－2053、CRL-2196三種細(xì)胞中Ppp1r11的表達(dá)水平，并具有良好的特異性。
　　結(jié)論：在CRL-1715、CRL－2053、CRL-219