Ipr1基因重組卡介苗對小鼠結(jié)核病治療效果的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 該研究先將綠色熒光蛋白GFP基因、分枝桿菌復(fù)制子Orim基因及胞內(nèi)病原體抗性基因1(Iprl基因)共同克隆進(jìn)入雙啟動子真核表達(dá)的載體pBudCE4.1中,構(gòu)建了pBOGI這一穿梭質(zhì)粒；把pBOGI重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入卡介苗BCG中,獲得了重組BCG疫苗；從而探討Iprl基因重組BCG在小鼠結(jié)核病模型中的治療效果。本研究旨在為探索Iprl基因增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染的固有免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:

2、r>　　 1.采用RT-PCR從小鼠C57BL/6J胸腺組織中擴(kuò)增出Iprl基因并克隆入pEGFP-C1質(zhì)粒中,獲得含有Iprl基因的pEGFP-Iprl重組質(zhì)粒。
　　 2.經(jīng)過嚴(yán)密次序的分步克隆,把GFP、Iprl和Orim基因共同克隆進(jìn)入雙啟動子真核表達(dá)的載體pBudCE4.1中,構(gòu)建了pBOGI共表達(dá)穿梭質(zhì)粒。然后用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,顯微鏡、RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)、Western Blotting檢測GF

3、P基因和Iprl基因的表達(dá)。
　　 3.把pBOGI電轉(zhuǎn)化入BCG中,獲得了可靶向遞送pBOGI重組質(zhì)粒進(jìn)入巨噬細(xì)胞并表達(dá)的重組BCG疫苗,在細(xì)胞水平和動物水平同時檢測Iprl基因的表達(dá)。
　　 4.BALB/c小鼠30只,隨機(jī)分為3組(n=10)；分別滴鼻給予磷酸鹽緩沖液(PBS)、BCG和重組BCG,2周后用人型Mtb H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株感染所有小鼠；感染后分別用PBS、BCG和重組BCG治療7次；末次治療后處死小鼠,

4、觀察肺脾組織荷菌量,肺脾臟器指數(shù),血清IFN-γ、IL-10及TNF-α分泌水平和肺脾組織中Iprl編碼蛋白的表達(dá),同時對比小鼠肺脾的病理變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.從小鼠C57BL/6J胸腺組織中擴(kuò)增出大小為1338bp的片段,真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Iprl構(gòu)建成功。
　　 2.限制性內(nèi)切酶酶切及DNA測序證實,pBOGI共表達(dá)穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。導(dǎo)入A549細(xì)胞,用RT-PCR、顯微鏡、免疫細(xì)胞化學(xué)、We

5、stern Blotting等方法觀測到了目的基因表達(dá)。
　　 3.成功構(gòu)建了能靶向傳遞Iprl重組質(zhì)粒入巨噬細(xì)胞的重組BCG疫苗,以其滴鼻小鼠BALB/c,RT-PCR法,免疫組化觀測到肺、脾組織中目的基因表達(dá)。
　　 4.重組BCG組肺脾組織荷菌量比PBS組及BCG組顯著降低；重組BCG組肺脾組織臟器指數(shù)比。PBS組及BCG組顯著降低；重組BCG組血清IFN-γ分泌水平比PBS組及BCG組顯著升高。用免疫組織化學(xué)法觀

6、測到小鼠肺脾組織中有Iprl基因編碼蛋白的表達(dá)。PBS組肺組織病理改變以滲出為主,病變廣泛；重組BCG組肺部病變最輕,肺泡結(jié)構(gòu)基本正常；BCG組病變范圍局限,病變程度界于PBS組與重組BCG組之間；各組之間比較脾組織病理改變不甚明顯。
　　 結(jié)論:
　　 1.綠色熒光蛋白GFP基因、分枝桿菌復(fù)制子Orim基因和Iprl基因在小鼠的巨噬細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)了共表達(dá)。
　　 2.攜帶外源治療性基因的重組卡介苗成功地構(gòu)建,并具有