EphA5在先天性甲狀腺功能減低大鼠腦中的表達(dá)及DNA甲基化調(diào)控.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了論述。
　　第一部分 先天性甲減大鼠模型的建立及原代胎鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)
　　目的:
　　建立先天性甲狀腺功能減低大鼠模型、培養(yǎng)原代胎鼠海馬神經(jīng)元及分組干預(yù)。
　　方法:
　　1.取妊娠日(Gestational day, GD) G0天孕大鼠,隨機(jī)分為三組,甲減組從G9天開(kāi)始給予母鼠含0.02％MMI的清潔飲用水直至仔鼠全部處死;T4治療組給予母鼠含0.02％MMI的清潔飲用水同甲減

2、組,且從分娩日(Postnatal day, PD)第7天即P7天開(kāi)始每日對(duì)仔鼠實(shí)施腹腔皮下注射甲狀腺素(T4);對(duì)照組一直給予清潔飲用水。
　　2.觀察母鼠及仔鼠一般生物學(xué)特性,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其體重變化及血清甲狀腺激素水平。
　　3.在P0,3,7,14,21天分別收集上述三組仔鼠海馬、大腦皮層、小腦,一部分存放于-80℃冰箱中備用,待作基因及蛋白分析;另一部分行石蠟包埋切片,待作免疫熒光染色。
　　4.于G17天取甲減組

3、和對(duì)照組胎鼠,斷頭分離海馬,用含B27、谷氨酰胺的Neurobasal無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元,倒置相差顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)變化。取培養(yǎng)7d的海馬神經(jīng)元,用MAP-2進(jìn)行鑒定及純度計(jì)算。
　　5.按照培養(yǎng)液不同,將培養(yǎng)的甲減組胎鼠海馬神經(jīng)元分為三組:T3組用含T3的培養(yǎng)液,Azadc組用含5-氮雜-2’-脫氧胞苷(Azadc)的培養(yǎng)液,Hypo-組用無(wú)血清培養(yǎng)液;并將同期培養(yǎng)的對(duì)照組胎鼠海馬神經(jīng)元作為對(duì)照組。鏡下觀察

4、不同培養(yǎng)液干預(yù)對(duì)甲減組海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)的影響,并用 MTT比色法測(cè)定以上四組海馬神經(jīng)元的活力。
　　結(jié)果:
　　1.母鼠在G18天時(shí),對(duì)照組的體重明顯高于甲減組與治療組(P<0.05);仔鼠出生后,三組母鼠體重均驟然下降,隨后在整個(gè)哺乳期體重逐漸增加,但對(duì)照組的母鼠體重增加速度高于甲減組與治療組,且在P3,7,14,21天對(duì)照組的母鼠體重明顯高于甲減組與治療組(P<0.05)。母鼠血清甲狀腺激素測(cè)定結(jié)果顯示在哺乳期末,甲減組和

5、治療組母鼠的血清FT3、FT4水平無(wú)顯著差異(P>0.05),但均顯著低于對(duì)照組水平(P<0.05)。
　　2.甲減組和治療組較對(duì)照組仔鼠體形小、行動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)萌出晚且光澤度降低。開(kāi)始睜眼和完全睜眼的時(shí)間甲減組均遲于對(duì)照組和治療組。對(duì)照組仔鼠出生體重顯著高于甲減組和治療組(P<0.05);治療組的仔鼠體重在P14天已顯著高于甲減組但仍低于對(duì)照組(P<0.05);直至P21天,治療組仔鼠體重與對(duì)照組已無(wú)顯著差異(P>0.0

6、5)。仔鼠甲狀腺激素測(cè)定結(jié)果顯示:治療組的仔鼠血清FT3、FT4水平在P14天,顯著高于甲減組水平(P<0.05),但仍顯著低于對(duì)照組水平(P<0.05);直至P21天,治療組的仔鼠血清FT3、FT4水平已達(dá)到對(duì)照組水平(P>0.05),均顯著高于甲減組水平(P<0.05)。
　　3.鏡下觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲減組海馬神經(jīng)元與對(duì)照組比較,在同一時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞胞體體積較小,突起形成的長(zhǎng)度較短、突起的支數(shù)較少,突起形成的網(wǎng)絡(luò)

7、密集程度較低;但是細(xì)胞純度均能達(dá)到96％以上。甲減組海馬神經(jīng)元經(jīng)不同藥液干預(yù)后突起增多增長(zhǎng)、網(wǎng)絡(luò)密集程度提高;MTT比色分析顯示:Azadc組和T3組的細(xì)胞活力均顯著高于Hypo-組,但這三組的細(xì)胞活力均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　母鼠、仔鼠甲狀腺激素水平及一般生物學(xué)特性表明先天性甲減組及治療組大鼠模型均成功建立。細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察、鑒定及活力測(cè)定表明原代正常和甲減胎鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)及藥物分組干預(yù)成功。<

8、br>　　第二部分 Ephrin-A5/EphA5信號(hào)通道在先天性甲減大鼠腦中的表達(dá)
　　目的:
　　研究ephrin-A5/EphA5信號(hào)通道及下游關(guān)鍵分子NMDAR-1(NR1)、PSD95、CaMKII在先天性甲減大鼠腦中的表達(dá)特征,并初步探討ephrin-A5/EphA5信號(hào)通道與甲狀腺激素缺乏致突觸發(fā)生障礙的關(guān)系。
　　方法:
　　1.分別于P0,3,7,14,21天,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)分析甲

9、減組、治療組、對(duì)照組海馬、大腦皮層、小腦組織ephrin-A5/EphA5及該通道下游關(guān)鍵分子NMDAR-1(NR1)、PSD95、CaMKII的mRNA表達(dá)水平,通過(guò)Western Blot方法進(jìn)行驗(yàn)證后,進(jìn)一步運(yùn)用免疫熒光染色檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平。
　　2.取培養(yǎng)7d的對(duì)照組和甲減組胎鼠海馬神經(jīng)元(包括T3組和Hypo-組),應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)分析ephrin-A5/EphA5及該通道下游關(guān)鍵分子NMDAR-1(NR1

10、)、PSD95、CaMKII的mRNA表達(dá)水平,通過(guò)Western Blot方法進(jìn)行驗(yàn)證后,進(jìn)一步運(yùn)用免疫熒光染色檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.在先天性甲減大鼠腦中,ephrin-A5、EphA5、NR1、PSD95、CaMKII基因和蛋白水平均下調(diào)且呈現(xiàn)顯著的時(shí)空特征。(1)在不同實(shí)驗(yàn)組之間比較的結(jié)果表明:P0~P21,ephrin-A5、EphA5、NR1、PSD95、CaMKII基因和蛋白的表達(dá)水平在甲減組

11、海馬、大腦皮層及小腦中均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),且下降幅度最大的時(shí)間點(diǎn)集中在P7天(除了小腦中的NR1);P0-P7,治療組的表達(dá)水平在海馬、大腦皮層及小腦與甲減組無(wú)顯著差異(P>0.05),P14-P21,治療組的表達(dá)水平已顯著高于甲減組但仍低于對(duì)照組(P<0.05)。(2)在不同腦組織之間比較的結(jié)果表明:P0-P21,甲減組、治療組、對(duì)照組的ephrin-A5、EphA5、NR1、PSD95、CaMKII基因和蛋白的表達(dá)水平

12、在海馬最高、大腦皮層其次、小腦最低,且在甲減組的海馬中表達(dá)水平下降幅度最大。(3)在發(fā)育的不同時(shí)間點(diǎn)之間比較的結(jié)果表明:ephrin-A5、EphA5、NR1、PSD95、CaMKII在甲減組的海馬、大腦皮層及小腦中的表達(dá)水平顯著升高的時(shí)間點(diǎn)較對(duì)照組延遲,且峰值出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)延遲或消失。
　　2.在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中,Hypo-組ephrin-A5、EphA5、NR1、PSD95、CaMKII基因和蛋白的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(

13、P<0.05);T3組的表達(dá)水平已顯著高于Hypo-組但仍低于對(duì)照組(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　Ephrin-A5/EphA5信號(hào)通道可能參與了先天性甲減大鼠神經(jīng)元的突觸發(fā)生障礙;甲狀腺素替代治療不能完全逆轉(zhuǎn)ephrin-A5/EphA5及該通道下游關(guān)鍵分子NR1、PSD95、CaMKII表達(dá)水平的下調(diào)。
　　第三部分 先天性甲減大鼠海馬中EphA5基因的DNA甲基化調(diào)控
　　目的:
　　檢測(cè)先天性

14、甲減大鼠海馬中EphA5基因啟動(dòng)子DNA甲基化水平,探討DNA甲基化與先天性甲減大鼠海馬中EphA5表達(dá)調(diào)控的關(guān)系。
　　方法:
　　1.取P7天的甲減組及對(duì)照組大鼠海馬組織各6份,及培養(yǎng)7d甲減組及對(duì)照組的海馬神經(jīng)元作為樣本。
　　2.應(yīng)用BSP克隆測(cè)序法檢測(cè)樣本的EphA5啟動(dòng)子CPG島DNA甲基化水平;應(yīng)用試劑盒測(cè)定樣本的DNMT活力。
　　3.取培養(yǎng)7d的甲減組胎鼠海馬神經(jīng)元(包括Azadc組和Hypo-

15、組),檢測(cè)其EphA5啟動(dòng)子CPG島DNA甲基化水平,同時(shí)應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)和Western Blot法分別檢測(cè)EphA5基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.先天性甲減大鼠海馬和原代培養(yǎng)的甲減組海馬神經(jīng)元中,EphA5啟動(dòng)子CPG島DNA甲基化水平均顯著高于對(duì)照組(t=10.15,13.74;p<0.001),與EphA5-mRNA表達(dá)水平均呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.957,-0.831;p<0.05

16、)。
　　2.先天性甲減大鼠海馬和原代培養(yǎng)的甲減組海馬神經(jīng)元中,DNMT活力均顯著高于對(duì)照組(t=36.01,63.17;p<0.001),與EphA5-mRNA表達(dá)水平均呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.998,-0.831;p<0.05)。
　　3.Azadc組與Hypo-組比較:EphA5基因DNA甲基化水平顯著下降(t=7.33,p<0.05),而EphA5基因mRNA和蛋白水平均顯著上調(diào)(t=7.07,6.42;p<0.05