成骨生長肽對OPG基因剔除小鼠骨質(zhì)疏松治療作用的分子機制.pdf

1、目的：
　　骨質(zhì)疏松癥是骨科常見疾病之一，隨著我國進入老齡化，骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生率逐年上升，是老年人致殘的主要因素。既往在研究骨質(zhì)疏松癥的動物模型中，骨保護素(osteoprotegerin，OPG)基因剔除小鼠模型符合高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥表現(xiàn)。成骨生長肽(osteogenic growth peptide，OGP)是一種在體外具有促進成骨細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞增殖、分化、成熟的作用，在體內(nèi)也能促進全身骨量增加的多肽。本研究通過體外培養(yǎng)O

2、PG基因敲除小鼠(OPG-/-)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymal stem cells，BMSCs)，并與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogeneticprotein-2，BMP-2)對照，探討OGP對體外培養(yǎng)的OPG-/-小鼠BMSCs的增殖和分化作用，分析OGP對其作用的分子機制，為OGP治療骨質(zhì)疏松癥提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.BMSCs分離培養(yǎng)：取12 w齡雄性O(shè)PG-/-小鼠，采用貼壁

3、法培養(yǎng)BMSCs，給予10％FBS的LG-DMEM(Low Glucose-Dulbecco modified eagle medium)和礦化液(10-8 mol/L地塞米松+10-2 mol/Lβ-甘油磷酸鈉+50 ug/ml L-抗壞血酸)的培養(yǎng)條件，進行BMSCs形態(tài)特征和生長特性觀察。
　　2.細(xì)胞增殖率觀察和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)含量測定：取第一代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(passage

4、 first，P1)分為OGP組、對照組和BMP-2組，各組分別取1d、3d、5d、7d四個時間點。在各個時間段，分別在所需檢測的培養(yǎng)孔內(nèi)，按照二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽法(methyl thiazolyl tetrazoliummethod，MTT)和磷酸對硝基苯法(p-nitrophenylphosphate，PNPP)分別測定細(xì)胞增殖率和堿性磷酸酶含量，與BMP-2對比，比較OGP對OPG-/-小鼠的BMSCs增殖率和ALP含量的變

5、化。
　　3.定量Real-Time PCR：按以上條件培養(yǎng)P1 BMSCs3 d后，分為三組，提取RNA，定量分析細(xì)胞周期指標(biāo)Cyclin A和CDK2、分化指標(biāo)Runx2和Osterix的基因水平表達，比較三組在mRNA水平的變化。
　　4.Western-blot分析：按以上條件培養(yǎng)P1 BMSCs7 d后，分為三組，觀察BMSCs增殖和向成骨細(xì)胞分化的相關(guān)蛋白水平的表達，與BMP-2比較，分析OGP對其作用的可能機制

6、。
　　結(jié)果：
　　1.OPG-/-小鼠的BMSCs形態(tài)特征和生長特性方面：在傳第三代的情況下，細(xì)胞生長速度很慢，很難融合，故我們選擇P1代細(xì)胞進行實驗。但在BMSCs形態(tài)上，顯微鏡下觀察未見明顯差異。
　　2.在含10％FBS的LG-DMEM和礦化液的培養(yǎng)的第3d、5d、7d，OGP對OPG-/-BMSCs增殖作用均高于空白對照組和BMP-2組(P<0.05)；OGP對OPG-/-小鼠的BMSCs ALP含量變化的作

7、用與空白對照組相似，而與BMP-2組存在較大差距，BMP-2在第3d、5d和7d的ALP含量均高于空白對照組和OGP組(P<0.05)。
　　3.定量Real-Time PCR分析表明：OGP組在細(xì)胞周期指標(biāo)Cyclin A和CDK2 mRNA水平明顯上調(diào)(P<0.01)，但在分化指標(biāo)Runx2和Osterix的基因水平與空白對照組相似，與BMP-2組相差較遠(yuǎn)。
　　4.各組均能觀察到相應(yīng)的抗體表達，OGP組在Cyclin

8、A和CDK2蛋白水平明顯升高(P<0.01)；BMP-2組在Runx2和Osterix蛋白水平較對照組明顯升高(P<0.01)，而OGP組與空白對照組相似。
　　結(jié)論：
　　1.OGP對OPG-/-小鼠BMSCs在10％FBS的LG-DMEM和礦化液的培養(yǎng)條件下，具有明顯促增殖作用，但是在ALP含量上明顯弱于BMP-2；
　　2.OGP對OPG-/-小鼠BMSCs增殖作用機制可能是通過激活CDK2/CyclinA途徑，