成骨細胞FGF23的表達與局部調(diào)節(jié)研究.pdf

1、目的:
　　通過體外培養(yǎng)新生大鼠頭蓋骨細胞,研究成骨細胞中成纖維細胞生長因子23(Fibroblastgrowthfactor23,FGF23)表達及鈣、磷、甲狀旁腺激素(parathyroidhormone,PTH)和1,25二羥維生素D(1,25(OH)2D3)對其表達的影響;研究FGF23表達水平與成骨細胞分化狀態(tài)的關(guān)系,并從1,25(OH)2D旁分泌/自分泌和細胞接觸通訊的角度研究其分化過程中高表達的局部調(diào)節(jié)機制。

2、　　方法:
　　1.體外分離培養(yǎng)新生大鼠頭蓋骨細胞,應(yīng)用堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)、茜素紅(Alizarinbordeauxstaining,ARS)染色等方法進行成骨細胞功能學(xué)鑒定。采用RT-PCR和蛋白印記(Westernblot)方法檢測FGF23在成骨細胞中的表達及鈣(5mmol/L氯化鈣)、磷(5mmol/L,β甘油磷酸鈉,β-GP)、PTH(10-9mol/LrhPTH(1-34))和

3、1,25(OH)2D3(10-8M)的作用;
　　2.分別于成骨細胞半?yún)R合、匯合、基質(zhì)堆積、礦化四個培養(yǎng)階段獲得不同分化狀態(tài)細胞,通過其ALP、骨鈣素(Osteocalcin,OCN)和骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)的mRNA表達水平變化進行分化狀態(tài)驗證。采用實時熒光定量PCR(Real-timePCR)和Westernblot技術(shù)檢測其FGF23mRNA和細胞內(nèi)FGF23蛋白水平的變化。
　　3.分別檢測成骨細

4、胞于增殖狀態(tài)(半?yún)R合)和分化狀態(tài)(匯合階段)的1α-羥化酶基因CYP2781和24-羥化酶基因CYP24A的mRNA表達水平,并通過1α-羥化酶底物25(OH)D3和羥化酶抑制劑酮康唑(Ketoconazole,KET)作用,觀察無血清培養(yǎng)條件下成骨細胞內(nèi)源性1,25(OH)2D對FGF23表達的影響。
　　4.觀察細胞在100μmol/L縫隙連接蛋白抑制劑甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)對成骨細胞匯合前后FGF23表

5、達的影響。
　　結(jié)果:
　　1.體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞中FGF23的mRNA和蛋白表達呈陽性。外源性10-8mol/L1,25(OH)2D3刺激后,成骨細胞FGF23的mRNA表達水平明顯上調(diào),約為對照組的16倍(p＜0.001),而CaCl2、β-GP、PTH刺激后FGF23mRNA表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.體外培養(yǎng)成骨細胞FGF23的表達呈分化階段性,分化成熟狀態(tài)(匯合階段)細胞FGF23表達顯

6、著上調(diào),其mRNA為半?yún)R合的增殖狀態(tài)細胞的7.5倍(p＜0.001),蛋白水平為增殖狀態(tài)細胞的126％?；|(zhì)堆積和礦化階段,FGF23mRNA回落至半?yún)R合水平,而其蛋白水平逐漸累及,基質(zhì)堆積期蛋白水平為增殖時期的207％(p＜0.05)。與增殖狀態(tài)細胞比較,分化狀態(tài)成骨細胞CYP27B1(編碼1α羥化酶)和CYP24A(編碼24羥化酶)表達上調(diào),其mRNA水平分別為增殖狀態(tài)的2倍(p＜0.05)和34倍(p＜0.001),提示內(nèi)源性1,

7、25(OH)2D功能的增強。
　　3.無血清培養(yǎng)時,在半?yún)R合和匯合階段加入100nmol/L25(OH)D3,明顯上調(diào)成骨細胞FGF23表達,其mRNA水平分別為對照組的16倍(p＜0.001)和28倍(p＜0.001)。對匯合階段細胞的刺激作用強于半?yún)R合階段。同時CYP2781表達增加(p＜0.05),CYP24A表達顯著增加,匯合前和匯合狀態(tài)成骨細胞CYP24AmRNA水平分別為對照組的1700倍(p＜0.001)和800倍(

8、p＜0.001)。10nmol/L羥化酶抑制劑KFT可有效阻斷該底物的刺激作用。
　　4.100μmol/L甘珀酸明顯抑制無血清培養(yǎng)中匯合階段成骨細胞FGF23表達,其mRNA水平較PBS對照組減少38％(p＜0.05),半?yún)R合階段細胞的抑制作用不明顯。
　　結(jié)論:
　　1.外源性1,25(OH)2D能強烈刺激體外培養(yǎng)成骨細胞FGF23的表達。
　　2.生理狀態(tài)下FGF23的表達與成骨細胞的分化狀態(tài)有關(guān),分化成熟