體外調(diào)節(jié)GJIC對(duì)兔成骨細(xì)胞成脂分化的影響.pdf

1、目的:通過(guò)利用縫隙連接激動(dòng)劑或縫隙連接阻滯劑調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞間縫隙連接通訊(gapjunction intracellular communication，GJIC)，來(lái)研究GJIC對(duì)成骨細(xì)胞成脂分化的影響，為骨量減少性疾病如骨質(zhì)疏松癥的治療提供新思路。
　　 方法:①提取出生一周內(nèi)的新西蘭大白兔乳兔顱骨，采用酶消化—組織塊聯(lián)合培養(yǎng)法提取成骨細(xì)胞并傳代培養(yǎng)至第三代，每2～3天換液，每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。②取鋪滿(mǎn)培養(yǎng)板的第

2、三代成骨細(xì)胞，采用鈣化結(jié)節(jié)染色法（茜素紅染色法）進(jìn)行成骨細(xì)胞的鑒定。③取第三代成骨細(xì)胞，常規(guī)消化后制備超薄切片，采用H-7500型透射電鏡觀察成骨細(xì)胞間縫隙連接超微結(jié)構(gòu)。④取第三代成骨細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)并誘導(dǎo)成脂分化，將成骨細(xì)胞分為三組:增強(qiáng)組加入終濃度為1μmol/L的縫隙連接激動(dòng)劑前列腺素E2(PGE2);抑制組加入終濃度為50μmol/L的縫隙連接阻滯劑18α-甘草次酸(18α-GA);設(shè)置空白對(duì)照組。倒置顯微鏡下每天觀察

3、細(xì)胞形態(tài)變化。⑤噻唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定1μmol/L的PGE2和50μmol/L的18α-GA對(duì)成骨細(xì)胞的增殖有無(wú)毒性作用。⑥三組細(xì)胞成脂誘導(dǎo)兩周后，分別采用油紅O脂肪染色法鑒定各組細(xì)胞中脂肪組織的生成。⑦三組細(xì)胞成脂誘導(dǎo)兩周后，分別采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中脂肪特異性標(biāo)記物—過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的mRNA表達(dá)水平。⑧三組細(xì)胞成脂誘導(dǎo)兩周后，分別采用蛋白免疫印跡法(Western-blo

4、t)檢測(cè)各組細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)水平。⑨將Cx43蛋白表達(dá)水平與PPARγmRNA表達(dá)水平進(jìn)行線性相關(guān)分析。
　　 結(jié)果:①倒置顯微鏡下觀察，第3天左右觀察到成骨細(xì)胞從碎骨片周?chē)纬?，原代成骨?xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈短梭形、三角形或多角形等不規(guī)則形態(tài)。第6天左右清除碎骨片，第9～12天成骨細(xì)胞基本鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶瓶底，即可進(jìn)行傳代。傳代培養(yǎng)后，成骨細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、鱗片形等形態(tài)，呈集落生長(zhǎng)趨勢(shì)。②取第三代成骨細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，結(jié)果顯示成骨細(xì)胞

5、聚集處有大量被染成橘紅色的鈣化結(jié)節(jié)出現(xiàn)，證明提取的細(xì)胞為成骨細(xì)胞。③透射電鏡觀察成骨細(xì)胞間縫隙連接，可以觀察到成骨細(xì)胞縫隙連接結(jié)構(gòu):每個(gè)縫隙連接由6個(gè)亞單位組成，位于相鄰細(xì)胞的細(xì)胞間隙和細(xì)胞質(zhì)之間，以利于細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。④MTT比色法結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)過(guò)1μmol/L的PGE2和50μmol/L的18α-GA處理24h后測(cè)490nm下吸光度（A值）顯示增強(qiáng)組、抑制組、對(duì)照組三組A值分別為0.221±0.007，0.228±0.01

6、1，0.219±0.012，三組之間兩兩相比較P值均大于0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明1μmol/L的PGE2和50μmol/L的18α-GA對(duì)成骨細(xì)胞增殖均無(wú)毒性作用。⑤油紅O染色顯示，三組細(xì)胞成脂誘導(dǎo)兩周后，細(xì)胞形態(tài)由原來(lái)的長(zhǎng)梭形、鱗片形逐漸變?yōu)闄E圓形，胞質(zhì)中均有被紅染的脂滴出現(xiàn)，證實(shí)三組細(xì)胞均向脂肪細(xì)胞分化。⑥RT-PCR結(jié)果顯示，三組細(xì)胞成脂誘導(dǎo)兩周后，增強(qiáng)組、抑制組、對(duì)照組三組PPARγmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.078±0

7、.022，1.106±0.085，0.425±0.041，增強(qiáng)組PPARγmRNA相對(duì)表達(dá)量分別與對(duì)照組和抑制組比較均明顯降低(P＜0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，抑制組PPARγmRNA與對(duì)照組比較表達(dá)明顯增高，(P＜0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑦Western-blot結(jié)果顯示，三組細(xì)胞成脂誘導(dǎo)兩周后，增強(qiáng)組、抑制組、對(duì)照組三組細(xì)胞Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.926±0.067，0.055±0.015，0.191±0.049

8、，增強(qiáng)組Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)量分別與對(duì)照組和抑制組比較明顯降低(P＜0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，抑制組Cx43蛋白與對(duì)照組比較表達(dá)明顯增高(P＜0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑧線性相關(guān)分析顯示，PPARγmRNA表達(dá)水平與Cx43蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，r=-0.8356，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:1.成骨細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)環(huán)境下可以向脂肪細(xì)胞分化。2.在成骨細(xì)胞成脂分化中，增強(qiáng)成骨細(xì)胞間GJIC可以抑制成骨細(xì)胞成脂