進(jìn)食富含ω-3多不飽和脂肪酸飲食對于反復(fù)性輕型顱腦損傷模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用研究.pdf

1、背景：
　　 顱腦創(chuàng)傷在一些發(fā)達(dá)國家已經(jīng)成為45歲以下人群致死或致殘的首要病因。在美國，每年約有170萬人遭受不同程度的顱腦外傷。隨著社會經(jīng)濟(jì)及交通的發(fā)展，中國顱腦外傷的發(fā)生率以及因顱腦外傷致死及致殘率也呈上升趨勢。越來越多的腦外傷患者需要接受長期的治療及生活護(hù)理，給家庭及社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。依據(jù)格拉斯哥顱腦創(chuàng)傷評分(GCS)，可將顱腦創(chuàng)傷分為3類：輕型顱腦外傷(格拉斯哥評分13－15分)、中度顱腦損傷(格拉斯哥評分9－12

2、分)以及重度顱腦損傷(格拉斯哥評分≤8分)。輕型顱腦外傷或腦震蕩是臨床最為常見的顱腦創(chuàng)傷類型，約占臨床腦外傷病例的80％。相比于中度顱腦損傷約15％和重度顱腦損傷約40％致死率，約1％的患者死于輕度顱腦損傷。與其他類型顱腦創(chuàng)傷臨床表現(xiàn)不同，輕型顱腦外傷主要以頭疼、情緒變化、睡眠障礙、記憶力及認(rèn)知功能障礙為臨床表現(xiàn)，臨床統(tǒng)稱為顱腦創(chuàng)傷后綜合征。近年來，關(guān)于反復(fù)性輕型顱腦創(chuàng)傷已越來越引起研究人員的關(guān)注，特別是對于運動員和軍人等一些反復(fù)輕型腦

3、外傷發(fā)生的高比例人群。
　　 各種體外或體內(nèi)實驗顯示顱腦損傷初始機制均為外傷導(dǎo)致的級聯(lián)神經(jīng)炎性反應(yīng)以及代謝功能異常。在之前的實驗性輕型顱腦外傷模型研究中，單次輕型顱腦創(chuàng)傷后實驗對象體內(nèi)可檢測到明顯的生化改變，但這些變化均為可逆改變，腦組織功能也可得到完全恢復(fù)。目前越來越多的臨床及實驗室證據(jù)表明，反復(fù)的輕型顱腦創(chuàng)傷可導(dǎo)致永久性的不可逆腦損傷。
　　 本次實驗?zāi)康耐ㄟ^建立單次或反復(fù)性輕型成年大鼠顱腦外傷模型，記錄不同組別顱腦

4、創(chuàng)傷后致死率及體重變化，并通過行為學(xué)實驗評估不同類型顱腦創(chuàng)傷對實驗對象空間獲取及記憶存儲等認(rèn)知功能方面的影響。同時，利用不同組織染色方法比較各類型顱腦創(chuàng)傷后急性神經(jīng)元變性凋亡及長期神經(jīng)細(xì)胞存活情況。同時我們根據(jù)前述實驗結(jié)果給予實驗大鼠進(jìn)食一段時間(傷前4周至傷后2周)富含ω3－多不飽和脂肪酸的飼料，研究其對于反復(fù)性輕型顱腦創(chuàng)傷的神經(jīng)保護(hù)潛能。最終建立一種穩(wěn)定可靠的與戰(zhàn)創(chuàng)傷及運動性顱腦創(chuàng)傷相關(guān)的實驗性腦損傷模型并驗證ω3－脂肪酸酸在反復(fù)性

5、輕型顱腦創(chuàng)傷中的預(yù)防及治療作用。
　　 第一部分，建立反復(fù)輕型創(chuàng)傷性腦外傷模型并比較不同組別腦創(chuàng)傷后致死率及體重變化
　　 一、目的：建立反復(fù)輕型性創(chuàng)傷性腦外傷大鼠模型，并記錄不同組別死亡率及創(chuàng)傷后體重變化。
　　 二、材料和方法：1)成年雄性SD大鼠47只，體重范圍(300-350克)。根據(jù)顱腦創(chuàng)傷類型將實驗對象隨機分為6組：1組(單側(cè)雙次，創(chuàng)傷時間間隔6小時，數(shù)量=8)；2組(單側(cè)雙次，創(chuàng)傷時間間隔24小時，

6、數(shù)量=8)；3組(雙側(cè)單次，創(chuàng)傷時間間隔1分鐘，數(shù)量=5)；4組(雙側(cè)雙次，創(chuàng)傷時間間隔6小時，數(shù)量=10)；5組(雙側(cè)雙次，創(chuàng)傷時間間隔24小時，數(shù)量＝8)；6組(對照組，單純行開顱手術(shù)，無顱腦創(chuàng)傷，數(shù)量=8)。在動物房內(nèi)管理飼養(yǎng)一周直至手術(shù)。2)實驗大鼠行氣管插管，呼吸機輔助呼吸，持續(xù)性吸入2％異氟烷維持麻醉，術(shù)中檢測大鼠呼吸、心率及體溫變化。根據(jù)不同創(chuàng)傷類型，實驗對象行單側(cè)或雙側(cè)開顱術(shù)。實驗性顱腦創(chuàng)傷模型由側(cè)方液壓打擊模型誘導(dǎo)形成

7、，顱腦創(chuàng)傷打擊強度根據(jù)外接傳感示波器測量，本次實驗打擊強度約為1.25倍大氣壓力，打擊次數(shù)及創(chuàng)傷時間間隔根據(jù)不同組別創(chuàng)傷類型予以區(qū)分。3)記錄并比較不同組別實驗大鼠顱腦損傷打擊強度、腦損傷前后體溫及腦溫變化以及復(fù)蘇時間等指標(biāo)。同時監(jiān)測各組大鼠腦損傷后恢復(fù)情況及體重變化，比較不同組別顱腦外傷后實驗大鼠死亡率。
　　 三、結(jié)果：1)不同組別實驗大鼠顱腦創(chuàng)傷前體重?zé)o明顯差異，單次顱腦創(chuàng)傷打擊強度及顱腦創(chuàng)傷前后體溫及腦溫變化無顯著差異。

8、與單純行開顱術(shù)無腦損傷組術(shù)后復(fù)蘇時間相比，所有類型顱腦損傷組術(shù)后復(fù)蘇時間均顯著延長(p<0.05)。雙側(cè)輕型顱腦外傷組較單側(cè)輕型顱腦外傷組傷后復(fù)蘇時間較長，但無明顯差異(p=0.578>0.05)，同時我們將本次實驗數(shù)據(jù)與之前中度實驗性顱腦創(chuàng)傷后復(fù)蘇時間相比，所有組別傷后復(fù)蘇時間明顯縮短(p<0.05)。2)相比于實驗性中度顱腦外傷約20％死亡率，所有不同類型輕型顱腦損傷組中實驗大鼠無一例死亡，腦外傷后死亡率為0。各組別實驗對象顱腦外傷

9、后恢復(fù)良好，無明顯肢體運動及平衡功能障礙。3)腦外傷后不同組別體重變化：所有輕型顱腦外傷組傷后體重均呈下降趨勢，比較不同組別腦外傷后體重下降程度及恢復(fù)時間，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示：1)雙側(cè)多次輕型顱腦損傷組較單側(cè)多次輕型顱腦損傷組，腦外傷后體重下降程度更嚴(yán)重，恢復(fù)至傷前體重水平所需時間明顯延長(5天vs11天)；2)雙側(cè)多次輕型顱腦損傷組較雙側(cè)單次輕型顱腦損傷組，腦外傷后體重下降程度明顯，恢復(fù)至傷前體重水平所需時間明顯延長(5天vs11天)；

10、3)單側(cè)多次輕型顱腦損傷組與雙側(cè)單次輕型顱腦損傷組相比，腦外傷后體重下降程度及恢復(fù)至傷前體重水平所需時間無顯著差別(5天vs5天)。
　　 四、結(jié)論：
　　 1.所有類型輕型顱腦損傷組別術(shù)后復(fù)蘇時間較無損傷組均顯著延長(p<0.05)。雙側(cè)輕型顱腦外傷組較單側(cè)輕型顱腦外傷組傷后復(fù)蘇時間較長，無統(tǒng)計學(xué)意義。與中度顱腦創(chuàng)傷相比，各類型輕型顱腦外傷傷后復(fù)蘇時間顯著縮短(p<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義。由此推測反復(fù)性輕型顱腦創(chuàng)傷其

11、腦組織損傷程度較單次輕型顱腦損傷較輕，腦組織功能恢復(fù)時間較短。
　　 2.相比于實驗性中度顱腦外傷(致傷強度約為2.15倍大氣壓力)約20％的死亡率，所有不同類型輕型顱腦損傷組中實驗大鼠無一例死亡，腦外傷后死亡率為0。各組別實驗對象顱腦外傷后恢復(fù)良好，無明顯肢體運動及平衡功能障。由此推測打擊強度是導(dǎo)致實驗對象腦外傷后死亡的主要因素，反復(fù)性輕型顱腦創(chuàng)傷強度不同于單次中度顱腦創(chuàng)傷。
　　 3.雙側(cè)多次輕型顱腦損傷組較其他類型

12、輕型腦損傷組可產(chǎn)生明顯的體重下降，其恢復(fù)至腦損傷前體重水平所需時間明顯延長?？烧J(rèn)為多次反復(fù)性輕型顱腦損傷腦組織損傷程度較重，恢復(fù)時間相對較長。
　　 第二部分，評估不同類型反復(fù)輕型創(chuàng)傷性腦損傷后對其認(rèn)知功能的影響
　　 一、目的：通過顱腦創(chuàng)傷后連續(xù)5天行為學(xué)測試，觀察并評估不同類型反復(fù)輕型創(chuàng)傷性腦損傷后對其認(rèn)知功能的影響。
　　 二、材料和方法：將不同類型輕型顱腦外傷組自腦創(chuàng)傷后12-16天連續(xù)5天行Morris

13、水迷宮行為學(xué)測試。整個行為學(xué)測試分為定位航行測試(placenavigation)及空間探索測試(spatialprobe)。1)定位航行測試：連續(xù)5天，每天將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中若干次，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間及游動速度和距離；2)空間探索測試：是在定位航行試驗最后一天測試后去除平臺，然后選定一個入水點將大鼠放入水池中，記錄其在一定時間內(nèi)的游泳軌跡，考察大鼠對原平臺的記憶。
　　 三、結(jié)果：
　

14、　 1)所有不同類型輕型顱腦損傷組別中實驗對象的游動速度及視力測試均無明顯差異。
　　 2)與無損傷對照組相比較，單側(cè)雙次輕型顱腦損傷組中大鼠在測試1-2天存在明顯認(rèn)知功能障礙，雙側(cè)單次輕型顱腦損傷組中大鼠在測試1-3天存在明顯的認(rèn)知功能障礙，而雙側(cè)多次輕型顱腦損傷組中大鼠則在測試1-5天內(nèi)存在認(rèn)知功能障礙。3)與無損傷對照組最終測試結(jié)果相比，雙側(cè)多次輕型顱腦損傷組中實驗大鼠存在明顯認(rèn)知功能障礙(第四組，p=0.003/第五組

15、，p<0.001)，而單側(cè)多次及雙側(cè)單次輕型顱腦損傷組中實驗大鼠與無損傷組比較無顯著差別。
　　 3)空間探索測試顯示：多側(cè)反復(fù)輕型顱腦創(chuàng)傷組其各區(qū)域內(nèi)游動軌跡相對較平均，而其他各組則表現(xiàn)出目標(biāo)區(qū)域相對集中性。
　　 四、結(jié)論
　　 1.單側(cè)多次及雙側(cè)單次輕型顱腦損傷組對腦創(chuàng)傷后認(rèn)知功能無顯著影響，可推測其損傷程度較輕，腦組織未造成永久性損傷，腦組織功能未受明顯影響。
　　 2.反復(fù)性輕型顱腦外傷可造成明

16、顯的認(rèn)知功能障礙，由此推測對于雙側(cè)重復(fù)性輕型腦創(chuàng)傷，6小時或24小時的時間間隔對于腦組織的功能恢復(fù)不夠充分，應(yīng)此連續(xù)的輕型腦創(chuàng)傷均可加重顱腦損傷程度。雖然與單次中度創(chuàng)傷性腦損傷相比，反復(fù)輕型顱腦創(chuàng)傷損傷程度更輕微，但重復(fù)的創(chuàng)傷累積可產(chǎn)生更為嚴(yán)重的長期性認(rèn)知功能障礙。
　　 第三部分，比較不同類型反復(fù)性輕型顱腦損傷后腦組織觀察區(qū)域急性神經(jīng)元變性及長期神經(jīng)細(xì)胞生存狀況
　　 一、目的：比較不同組別腦外傷后神經(jīng)細(xì)胞存活情況，研

17、究不同類型輕型顱腦損傷對腦組織的損傷程度。
　　 二、材料和方法：
　　 更據(jù)不同類型組織學(xué)染色要求，分別隨機抽取不同組別實驗大鼠于傷后24小時內(nèi)或行為學(xué)測試最后一天(腦創(chuàng)傷后16天)通過4％多聚甲醛灌流(每只大鼠約150毫升)并固定腦組織，經(jīng)不同濃度蔗糖溶液浸泡保護(hù)后，將腦組織至于干冰冷凍，于切片機上將冰凍腦組織以每層45微米的厚度連續(xù)冠狀切片，選取10張腦組織貼片。室溫晾干組織切片后，分別行FluoroJade-B組

18、織熒光染色及甲酚紫(CV)染色評估不同組別神經(jīng)細(xì)胞受損情況，同時與先前實驗性中度創(chuàng)傷性腦損傷大體腦組織形態(tài)及神經(jīng)細(xì)胞存活情況相比較，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 三、結(jié)果：
　　 1)腦外傷后16天腦組織大體形態(tài)學(xué)比較：與中度顱腦創(chuàng)傷后受傷區(qū)域腦組織?？梢娺B續(xù)性疤痕或組織缺損不同，僅雙側(cè)多次或單側(cè)雙次輕型顱腦損傷組腦組織損傷局部可見輕微皮層下瘢痕或含鐵血黃素沉積，其余單次輕型腦創(chuàng)傷組腦組織打擊致傷區(qū)域未見明顯疤痕或腦組織皮層

19、缺損。光鏡下甲酚紫(CV)染色結(jié)果同時顯示，所有反復(fù)性輕型顱腦損傷組大鼠腦組織損傷相關(guān)區(qū)域未見缺血梗死或出血灶及外傷后瘢痕組織形成。
　　 2)所有不同類型輕型腦創(chuàng)傷組其創(chuàng)傷區(qū)域的頂葉皮層及丘腦均可見明顯的FJ-B陽性熒光染色(p<0.05)，隨著打擊次數(shù)的增加，腦損傷后急性神經(jīng)元變性數(shù)量隨之增加，利用立體測量細(xì)胞計數(shù)軟件分析系統(tǒng)計算比較不同腦損傷組別外傷后急性期變性死亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量結(jié)果顯示單次反復(fù)性輕型顱腦損傷較單側(cè)單次輕型

20、顱腦損傷相比，表現(xiàn)出增加神經(jīng)細(xì)胞變性數(shù)量的趨勢。
　　 3)通過甲紫酚染色觀察比較不同類型反復(fù)性輕型顱腦損傷后同側(cè)腦組織海馬CA3區(qū)長期神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量結(jié)果提示所有不同類性顱腦損傷后均可導(dǎo)致不同程度的長期存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量下降，且各不同組別腦外傷后神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量有顯著差異(p<0.01)。單次輕型顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量與無損傷組無顯著差別(p>0.05)。反復(fù)性即同側(cè)2次輕型顱腦損傷，無論創(chuàng)傷時間間隔6或24小時，均可產(chǎn)生最

21、顯著的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量下降(p<0.01)。
　　 四、結(jié)論
　　 1)傷后24小時FJ－B熒光染色結(jié)果提示各種類型輕型顱腦損傷均可造成受傷區(qū)域海馬及皮層不同程度急性神經(jīng)細(xì)胞變性死亡，反復(fù)性輕型顱腦由于打擊次數(shù)增加，可導(dǎo)致急性腦損傷程度加重及表現(xiàn)出增加變性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的趨勢。
　　 2)傷后腦組織大體形態(tài)學(xué)表明，腦組織機械損傷程度主要與瞬間顱腦打擊強度有關(guān)，輕型顱腦損傷由于腦組織機械性打擊程度較輕，相比于中度顱腦損傷

22、，腦組織大體形態(tài)病理學(xué)無特殊改變。
　　 3)甲酚紫(CV)染色結(jié)果顯示多次反復(fù)輕型顱腦損傷可惡化繼發(fā)性腦損傷程度，表現(xiàn)為顯著增加腦組織損傷相關(guān)區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞丟失數(shù)量，造成腦組織不可逆的損傷。
　　 第四部分，ω3－魚脂酸對反復(fù)性輕型創(chuàng)傷性腦損傷保護(hù)作用的實驗研究
　　 一、目的：確立ω3－魚脂酸對反復(fù)性輕型顱腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用并探討其對腦外傷后大鼠認(rèn)知功能的影響。
　　 二、材料和方法：
　　

23、將32只實驗大鼠(體重約150克，出生時長：6周)隨機根據(jù)飼養(yǎng)食物不同分為兩組，每組各16只，其中一種食物中富含ω3－魚脂酸，而另一組食物以普通實驗飼料為對照。所有大鼠與腦損傷前4周開始進(jìn)食不同食物，并持續(xù)進(jìn)食至傷后2周，直至行為學(xué)實驗完成。實驗期間記錄每天不同組別實驗動物的體重變化。顱腦創(chuàng)傷后10－14天連續(xù)5天行Morris水迷宮行為學(xué)測試，分別記錄每只實驗大鼠游向平臺時間及游行速度。評估空間認(rèn)知及記憶功能。行為學(xué)測試最后一天(腦創(chuàng)

24、傷后16天)通過4％多聚甲醛灌流(每只大鼠約150毫升)并固定腦組織，經(jīng)不同濃度蔗糖溶液浸泡保護(hù)后，將腦組織至于干冰冷凍，與切片機上冠狀切面將冰凍腦組織以每層45微米的厚度切片、貼片。室溫晾干組織切片后，行甲酚紫(CV)染色評估不同組別神經(jīng)細(xì)胞受損情況，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 三、結(jié)果：
　　 1)兩組中顱腦外傷打擊強度、傷后意識及反射恢復(fù)時間、損傷前后體溫及腦溫變化無顯著性差別。顱腦外傷前進(jìn)食不同食物4周時間，各組別

25、大鼠體重增長比率無差別，但傷后體重記錄顯示，進(jìn)食富含ω3－魚脂酸飼料組大鼠可明顯減輕體重減少程度(311±25gvs321±22g)，恢復(fù)至腦外傷前基礎(chǔ)體重時間較對照飲食治療組縮短。
　　 2)兩組不同飲食組于腦損傷后10－14天行水迷宮行為學(xué)評估，其中各組中實驗對象的游動速度及視力測試均無明顯差異。進(jìn)食富含ω3－魚脂酸飼料的實驗大鼠腦外傷后較進(jìn)食普通飼料的實驗大鼠在認(rèn)知功能方面有明顯改善。比較行為學(xué)測試最后一天各組別游向平臺時

26、間，ω3－魚脂酸飲食組平均用時顯著縮短(p=0.030,p<0.05)。空間探索測試結(jié)果顯示，二組實驗大鼠均表現(xiàn)出目標(biāo)區(qū)域相對集中性，進(jìn)食富含ω3－魚脂酸組大鼠與目標(biāo)區(qū)域游動時間相對較長(22.8±3.6秒vs19.7±2.9秒)。
　　 3)組織學(xué)檢查結(jié)果：各組別大鼠與行為學(xué)測試最后一天(腦外傷后16天)處死，提取腦組織標(biāo)本行甲酚紫(CV)染色，用以評估不同組別神經(jīng)細(xì)胞長期生存狀況。腦組織大體形態(tài)學(xué)比較(4×)：進(jìn)食普通實驗飼

27、料組大鼠較進(jìn)食富含ω3－魚脂酸組大鼠相比，其腦組織海馬顆粒層厚度及細(xì)胞密度減少。光鏡下甲酚紫(CV)染色結(jié)果同時顯示(100×)，不同飲食組雙側(cè)海馬CA2/3區(qū)域平均神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量比較結(jié)果上無顯著性差異(左側(cè)：p=0.149p>0.05；右側(cè)：p=0.253p>0.05)，然而，進(jìn)食富含ω3－魚脂酸組顯示出可減少神經(jīng)細(xì)胞死亡的趨勢。
　　 四、結(jié)論
　　 1)各組大鼠傷后無死亡率。腦外傷前至傷后一段時間進(jìn)食ω3－脂肪酸，可

28、滿足機體顱腦外傷后的高代謝及能量需求狀態(tài)，明顯減輕反復(fù)性輕型顱腦創(chuàng)傷后體重下降，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，改善傷后恢復(fù)。
　　 2)反復(fù)性輕型顱腦損傷組可產(chǎn)生明顯的認(rèn)知功能障礙，進(jìn)食富含ω3－魚脂酸飼料可明顯改善腦外傷后空間認(rèn)知及記憶功能，并顯示出更明顯的目標(biāo)區(qū)域的偏好性。
　　 3)甲酚紫(CV)染色結(jié)果顯示雖然二組不同飲食組在平均神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目皮較無顯著性差異，但與進(jìn)食普通實驗飼料組大鼠相比，進(jìn)食富含ω3－魚脂酸飼料的大鼠顯示