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文檔簡介
1、本課題首先建立梗阻性黃疸(obstructive jaundice,OJ)動物模型,予以應(yīng)用富含ω-3多不飽和脂肪酸的魚油干預(yù),并行腹部胸導(dǎo)管置管引流淋巴液,通過對外周血液、淋巴液中細胞因子(TNF-α、IL-1β及IL-10)、NO及高遷移率族蛋白1(HMGB1)測定,明確ω-3 PUFA干預(yù)的影響;推測上述細胞因子或炎癥介質(zhì)的可能來源。進一步對比分析腸粘膜組織中HMGB1與Toll樣受體-4(TLR4)及核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB
2、)蛋白表達變化,明確“腸—淋巴途徑”及HMGB1等在OJ導(dǎo)致腸屏障功能損害中的作用,然后應(yīng)用富含ω-3 PUFA處理,進一步探討ω-3多不飽和脂肪酸對OJ機體保護作用的可能機制。
第一部分:ω-3 PUFA干預(yù)梗阻性黃疸大鼠血液及淋巴液中細胞因子對比觀察
目的:1.改良腹部胸導(dǎo)管置管過程,建立簡潔的淋巴管置管及淋巴液引流的方法。2.對比觀察血液及淋巴液中TNF-α、IL-1β、IL-10、NO及HMGB1含量變化,以
3、及ω-3 PUFA干預(yù)后的影響。
方法:SPF級雄性wistar大鼠72只,隨機分為:梗阻性黃疸(OJ)組(n=24),梗阻性黃疸+ω-3 PUFA組(OJPUFA)組(n=24)及Sham組(n=24)。根據(jù)標本收集時間的不同,再次隨機分為d3、d7及d14三組。梗阻性黃疸模型通過膽總管雙重結(jié)扎法建立,僅OJPUFA組動物自術(shù)后第1天,給予ω-3 PUFA按0.4 g.kg-1.d-1劑量灌胃,其余組動物相應(yīng)時間點等量生理鹽
4、水灌胃作為對照。各組大鼠分別于術(shù)后第3、7、14天腹部胸導(dǎo)管置管收取淋巴液,以及下腔靜脈血液、回腸組織等標本,分別予以置-80℃冰箱或10%中性甲醛固定后保存。利用全自動生化分析儀檢測總膽紅素(TBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)等生化指標。ELISA測定TNF-α、IL-1β、IL-10及HMGB1含量,硝酸還原酶(微板法)測定NO含量。
結(jié)果:
1.通過充分游離腹主動脈間接顯露腹部胸導(dǎo)管,操作過
5、程簡單,置管成功率高,收集淋巴液量相對較大,能滿足后續(xù)實驗要求。
2.一般情況:本實驗所有動物均未發(fā)生術(shù)后切口感染或切口裂開等并發(fā)癥,實驗過程中OJ14d組死亡1只(腸梗阻),余無動物死亡。OJ與OJPUFA組大鼠術(shù)后第1-3天,體重有下降趨勢,7天以后均恢復(fù)至術(shù)前體重,但任一相同時間點,較Sham組體重明顯減低; d14時間點時OJPUFA組大鼠體重高于OJ組,且差異有顯著性(P=0.000<0.05),但都顯著低于Sham
6、組(P<0.05)。
3.肝臟功能指標變化:Sham組TBIL及DBIL水平在整個實驗過程中沒有明顯變化,OJ組與OJPUFA組血清TBIL及DBIL水平自術(shù)后第3日起較Sham組明顯增高,但該兩組之間相比差異均無顯著性(P=0.786,0.790,0.881>0.05),(P=0.855,0.324,0.530>0.05)。Sham組ALT及AST水平在整個實驗過程中波動幅度較小。OJ組與OJPUFA組中血清ALT及AST水
7、平,自術(shù)后第3天起較Sham組明顯增高,但差異無顯著性,隨時間推移,此二者血清水平均成進行性升高趨勢,至術(shù)后14天,OJ組ALT及AST均顯著高于OJPUFA組(P=0.014,0.012<0.05)。
研究結(jié)論:
1.通過充分游離腹主動脈來間接顯露腹部胸導(dǎo)管,符合此二者之間的解剖關(guān)系,更有利于胸導(dǎo)管顯露,創(chuàng)傷減少,操作簡單,淋巴液引流量相對較大,可用于需要開腹手術(shù)的大鼠疾病模型中引流淋巴液的研究。
2.ω
8、-3多不飽和脂肪酸干預(yù)后,在一定程度上改善了大鼠體重及肝臟功能,但在膽道梗阻未解除的前提下,ω-3 PUFA干預(yù)對大鼠一般情況及肝臟功能的改善等方面作用是有限的。
3.ω-3多不飽和脂肪酸干預(yù),能減弱促炎因子HMGB1、TNF-α及IL-1β的釋放,避免IL-10水平過度升高,改善OJ機體免疫紊亂狀態(tài),減弱機體大量分泌NO所介導(dǎo)的損害反應(yīng)。
4.TNF-α及IL-1β可能主要來源于OJ機體腸道淋巴等組織的分泌;淋巴液
9、中IL-10及NO可能不是OJ機體的主要來源。而HMGB1在膽道梗阻后早期,淋巴液中的HMGB1可能不是機體的主要來源,但隨梗阻時間延長,腸道淋巴等組織的分泌增加更為顯著。
第二部分:ω-3PUFA對梗阻性黃疸大鼠小腸損傷的影響及機制
目的:觀察ω-3 PUFA對梗阻性黃疸大鼠回腸形態(tài)學(xué)及杯狀細胞數(shù)量變化的影響;以及HMGB1/TLR4信號轉(zhuǎn)到途徑在OJ損害中的作用及可能機制。
方法:本研究第一部分留取的回
10、腸標本,應(yīng)用于本實驗研究。HE及AB-PAS染色觀察腸粘膜形態(tài)學(xué)及杯狀細胞變化;免疫組織化學(xué)染色觀察HMGB1、TLR4及NF-Kb p65在腸粘膜表達變化;qRT-PCR及Western-blot檢測回腸組織HMGB1、TLR4及NF-Kb p65 mRNA及蛋白表達變化。
結(jié)果:
1.腸道組織病理學(xué)變化
假手術(shù)組:腸絨毛結(jié)構(gòu)清晰,無充血水腫,間質(zhì)內(nèi)無明顯炎性細胞浸澗,上皮細胞完整。OJ組:自d3開始,粘
11、膜絨毛水腫逐漸加重,間質(zhì)可見充血,炎性細胞浸潤逐漸增多,絨毛之間的間隙逐漸增大,粘膜高度逐漸降低,腺窩深度變淺,開口逐漸增寬,絨毛長度與腺窩深度的比例逐漸降低,在d14時間點,絨毛顯著縮短,可見部分絨毛上皮細胞脫落缺失明顯,部分區(qū)域潰瘍形成。OJPUFA組,在d3、d7時間點,肉眼觀無明顯差別,至d14時間點可見絨毛粗短,但結(jié)構(gòu)相對完整,絨毛脫落及潰瘍形成少見。對第14天,小腸絨毛高度、隱窩深度以及二者的比值進一步對比可見,假手術(shù)組絨毛
12、高度顯著高于OJ組及OJPUFA組,且以O(shè)J組降低更為顯著,與OJPUFA組相比(P=0.000<0.05);在隱窩深度方面的變化趨勢與絨毛高度變化趨勢相近;而對于絨毛高度/隱窩深度比值方面,假手術(shù)組顯著高于OJ組及OJPUFA組(P<0.05),差異有顯著性。盡管OJPUFA組高于OJ組,但二者比較無顯著性差異(P=0.107>0.05)。
2.AB-PAS染色顯示回腸杯狀細胞吸光度值變化
Sham組大鼠中,小腸杯
13、狀細胞呈藍染,均勻分布于腸黏膜上皮內(nèi),細胞飽滿,在各時間點無明顯差異。而OJ組和OJPUFA組大鼠,腸絨毛水腫顯著,在d3時間點杯狀細胞吸光度值稍高于假手術(shù)組,在d7、d14時間點杯狀細胞數(shù)量明顯減少,均顯著低于任一相同時間點假手術(shù)組含量,且OJ組下降更為明顯,在d14時間點,顯著低于OJPUFA組水平(P=0.035<0.05)。
3.回腸組織中HMGB1,TLR4及NF-κb p65蛋白表達變化
3.1 HMGB
14、1
Sham組大鼠腸粘膜上皮細胞內(nèi)僅見少許淡黃色顆粒,在任何時間點表達均不顯著。而OJ和OJPUFA組在d3時間點就可見顯著黃染,染色陽性區(qū)域主要位于絨毛頂端,主要位于腸粘膜上皮細胞核內(nèi),胞漿內(nèi)表達少,同時間質(zhì)中的炎癥細胞也可見陽性表達。d7時間點,OJ組整個絨毛上皮細胞的胞核及胞漿均可見明顯黃染,間質(zhì)中的炎癥性細胞的表達量亦明顯增加;而OJPUFA組的陽性表達主要位于細胞核內(nèi),也呈現(xiàn)彌漫性表達增強。在d14時間點,在OJ組中
15、HMGB1表達也顯著增強,腸粘膜上皮細胞胞核、胞漿甚至胞外都可見明顯棕黃色乃至棕褐色顆粒沉著,間質(zhì)中的炎癥細胞也呈現(xiàn)相同的染色結(jié)果。OJPUFA組也有相似變化趨勢,但染色程度明顯變淺。
3.2 TLR4
Sham組大鼠腸粘膜上皮細胞膜表面未見明顯黃染。OJ和OJPUFA組在d3肘間點就可見少許黃染,位于絨毛頂端,在d7時間點,OJ組腸上皮細胞膜表面可見明顯黃染,間質(zhì)中的炎癥性細胞也可見少許陽性表達;在d14時間點,O
16、J組腸絨毛頂端細胞膜顯著黃染,致部分上皮細胞膜清晰可見;而OJPUFA組陽性表達程度明顯弱于OJ組。Western-blot顯示,Sham組大鼠TLR4始終維持于較低水平,與免疫組化染色結(jié)果一致。d3時間點開始,OJ組和OJPUFA組大鼠小腸內(nèi)TLR4的含量均顯著高于假手術(shù)組,且表達量逐漸增多,OJ組變化最為顯著。在d14,OJ組小腸內(nèi)TLR4的水平即顯著高于OJPUFA組(P=0.000<0.05)。
3.3 NF-κb p
17、65
Sham組大鼠腸粘膜上皮細胞核內(nèi)僅見少許淡黃色顆粒,OJ組和OJPUFA組在d3、d7時間點,細胞核內(nèi)可見顯著黃染,染色陽性區(qū)域彌漫分布于整個絨毛,陽性表達主要位于腸粘膜上皮細胞核內(nèi),胞漿內(nèi)表達少,間質(zhì)中的炎癥細胞也可見陽性表達。在d14時間點,OJ組腸粘膜上皮細胞的胞核及胞漿內(nèi)均可見明顯黃染甚至棕褐色顆粒,并呈片狀連續(xù)性、強陽性表達,整個絨毛及隱窩區(qū)內(nèi)上皮細胞胞漿及胞核均可見明顯黃染,并且間質(zhì)中炎癥細胞的表達量也明顯增
18、加。而OJPUFA組的陽性表達主要位于細胞核內(nèi),也呈現(xiàn)彌漫性表達增強,胞漿陽性表達程度相對較弱,間質(zhì)中炎癥細胞胞核及胞漿也有陽性表達。
結(jié)論:
ω-3PUFA可改善梗大鼠阻性黃疸導(dǎo)致的腸絨毛高度減退,改善絨毛高度/隱窩深度比值,減弱梗阻性黃疸機體中腸粘膜上皮的損害,并可改善腸粘膜上皮中杯狀細胞的數(shù)量和功能。梗阻性黃疸可促進大鼠腸管組織中HMGB1/TLR4/NF-κ B通路的活化,損害腸粘膜屏障功能;ω-3多不飽和脂
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