PDX1聯(lián)合多種細胞因子調(diào)控微環(huán)境誘導人胎盤MSCs向胰島β樣細胞分化的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 人胎盤間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、擴增及鑒定
　　目的:
　　建立人胎盤間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)在體外分離、培養(yǎng)、擴增和鑒定的方法,并探討其生物學特性及其部分分化潛能。
　　方法:
　　獲取人胎盤4-5cm2,肝素化后用密度梯度離心法,利用間充質(zhì)細胞貼壁生長的特點,不斷純化分離人胎盤MSCs并體外擴增、培養(yǎng)。顯微鏡

2、仔細觀察細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu);了解其增值能力并建立細胞生長曲線;RT-PCR檢測干細胞特異性標志物SSEA-4和Oct-4在3-4代人胎盤MSCs中表達情況;流式細胞學檢測其表面分子標志的表達;采用特殊的培養(yǎng)基孵育3W后,誘導人胎盤MSCs向成骨細胞和脂肪細胞分化,用油紅O染色和茜素紅染色鑒定。
　　結(jié)果:
　　原代細胞接種2-3d后開始貼壁,5-7d后增殖速度增快,12-15d原代細胞匯合達80％-90％,原代細胞及傳代細胞形態(tài)

3、學觀察呈旋渦狀生長和典型的成纖維樣形態(tài);細胞傳代培養(yǎng)5-7d時增殖速度明顯,在8-9d時達到平臺期。流式檢測顯示 CD29和CD105陽性;人胎盤 MSCs表達干細胞標志 SSEA-4和Oct-4。誘導后人胎盤 MSCs細胞變圓逐漸呈現(xiàn)脂肪油滴,其油紅 O染色成紅色;成骨誘導茜素紅染成紅色。
　　結(jié)論:
　　成功分離、純化出人胎盤 MSCs并鑒定。
　　第二部分 PDX1聯(lián)合多種細胞因子調(diào)控微環(huán)境誘導人胎盤 MSCs向

4、胰島β樣細胞分化的體外研究
　　目的:
　　構(gòu)建含胰十二指腸同源框-1基因(pancreatic and duodenal homeobox factor1, PDX1)的重組腺病毒載體,探討Pdx1修飾人胎盤間充質(zhì)干細胞(HUC-MSCs)體外分化為胰島素分泌細胞。
　　方法:
　　將pUC57-PDX1用BglII/XhoI酶酶切下PDX1,連接到pShuttle-GFP-CMV重組穿梭載體,收獲pShutt

5、le-GFP-CMV-PDX1質(zhì)粒,將pShuttle-GFP-CMV- PDX1轉(zhuǎn)接到pAdxsi載體上,收獲pAdxsi-GFP-PDX1重組病毒質(zhì)粒,重組病毒感染293細胞,包裝出完整的腺病毒。用攜帶PDX1基因的重組腺病毒(Adxsi-CMV-PDX1)感染MSCs7d后,實驗組聯(lián)合以下多種生長分化因子分階段誘導分化:人表皮生長因子(EGF)、B27、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、人β細胞調(diào)節(jié)素、煙酰胺(NIC)、β-巰基乙

6、醇。RT-PCR檢測誘導后細胞PDX1、胰島素(insulin)、葡萄糖轉(zhuǎn)運體2(Glut2)的表達;Western blot檢測PDX1和insulin表達;免疫細胞化學染色、免疫熒光染色和化學發(fā)光法檢測insulin和C肽表達;再用25mmol/L高糖刺激1h后,檢測insulin與C肽的分泌水平變化;用流式細胞術(shù)檢測誘導后細胞insulin(+)細胞百分率。
　　結(jié)果:
　　通過測序、酶切等鑒定PDX1基因正確插入穿梭

7、質(zhì)粒中,并與病毒骨架質(zhì)粒重組,重組腺病毒可高效感染HUCMSCs。誘導后的細胞經(jīng)雙硫腙(DTZ)染色胞漿呈亮紅色;RT-PCR、免疫細胞化學染色、免疫熒光染色和Western blot可以檢測到誘導后的細胞表達PDX1、insulin和glut-2胰島相關(guān)基因和蛋白,實驗組在誘導第10d,上清液中胰島素和C肽的分泌量分別為264.32±21.19 mU/L、0.21±0.12 ng/mL,第17d胰島素和C肽的分泌量分別為482.22±

8、56.41 mU/L、2.32±0.54 ng/mL,在25mmol/L高糖協(xié)同作用1h后,胰島素和C肽的含量分別達972.43±65.28 mU/L、3.52±0.93 ng/mL。對照組第10d、17d和17d+高糖胰島素分泌量分別是(6.81±2.71)mU/L、(11.37±3.25)mU/L和(11.25±1.26) mU/L,而C肽未檢測到。實驗組和對照組之間及實驗組不同時間段差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗組用流

9、式細胞術(shù)檢測誘導后insulin(+)細胞百分率為12.31±5.62％,對照組為0.00％(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建了Pdx1腺病毒載體。PDX1修飾胎盤間充質(zhì)干細胞后,聯(lián)合細胞因子誘導在體外能夠誘導分化為胰島素分泌細胞,胰島素和C肽分泌水平較高,且能夠響應高糖的刺激。
　　第三部分 PDX1聯(lián)合多種細胞因子調(diào)控微環(huán)境誘導人胎盤 MSCs向胰島β樣細胞分化的體內(nèi)研究
　　目的:
　　檢測

10、人胎盤 MSCs體外誘導分化成功的胰島β樣細胞移植對Ⅰ型糖尿病鼠的療效。
　　方法:
　　通過腹腔注射大劑量的鏈脲佐菌(STZ)藥物誘導免疫缺陷裸鼠建立Ⅰ型糖尿病模型。A組在糖尿病鼠腎包膜下注射誘導后的人胎盤 MSCs,B組腎包膜下注射未誘導的人胎盤 MSCs。以糖尿病鼠和正常裸鼠為對照組。連續(xù)觀察鼠血糖、體重及存活時間的變化。于移植后低5天及第30天取移植物行 HE和胰島素染色。
　　結(jié)果:
　　糖尿病鼠的成膜