SIRT3在原發(fā)性肝癌中的表達及其抑瘤作用的研究.pdf

1、原發(fā)性肝細胞癌是全世界最常見惡性腫瘤之一,其死亡率在惡性腫瘤中位于胃癌、食道癌之后居第三位。我國是原發(fā)性肝細胞癌的高發(fā)區(qū),我國每年死于肝癌的人數(shù),約占全世界肝癌死亡人數(shù)的50％。近20年來,雖我國的肝癌治療水平取得了長足的進步,但肝癌的發(fā)病率和死亡率仍位于癌癥中第二位。
　　SIRT3是沉默信息調(diào)節(jié)因子家族(Sirtuins,silent information regulator)中一員,線粒體內(nèi)主要的去乙酰化酶,近年新發(fā)現(xiàn)的一

2、種抑癌基因,但當前,對于SIRT3在肝癌發(fā)病過程中發(fā)揮的作用尚無相關(guān)研究報道。因此,進一步研究揭示SIRT3在肝癌中的作用和功能,為肝癌診斷及治療提供依據(jù)有著十分重要的意義。
　　本研究分為三部分:
　　第一章SIRT3在原發(fā)性肝細胞癌中的表達及臨床意義
　　目的：
　　觀察SIFRT3在原發(fā)性肝細胞癌中的表達,并分析其在肝癌中表達的意義。
　　方法：
　　采用免疫組織化學(xué)和Westem-blotti

3、ng實驗方法檢測在32例原發(fā)性肝細胞癌的癌和癌旁組織及10例正常肝組織中表達情況,并分析及意義。
　　結(jié)果：
　　1、免疫組化實驗結(jié)果在32例肝癌石蠟組織標本中,共有19例呈陽性表達,但無強陽性表達,SIRT3的陽性表達率為59.38％(19/32);癌旁肝硬化組織中共例31阻性表達,SIRT3的陽性表達率為96.88％(31/32),其中18例呈強陽性表達;而10例正常肝組織中全部呈陽性表達,其陽性表達率為100.0％(1

4、0/10),并有7例呈強陽性表達。肝癌組織與癌旁肝硬化、正常肝組織相比較,SIRT3陽性表達率及陽性評分均數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而癌旁組織與正常肝組織之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2、Western-blotting實驗結(jié)果在32例肝癌組織中SIRT3蛋白的表達量(SIRT3/GAPDH)明顯低于癌旁肝硬化組織的蛋白表達量及正常肝組織的蛋白表達量,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。雖然癌旁組織中的

5、SIRT3蛋白表達水平略低于正常肝組織,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3、肝癌組織中SIRT3蛋白表達量與臨床病例資料的關(guān)系結(jié)果32例肝癌組織中SIRT3的表達水平與性別、年齡、AFP值、腫瘤大小及有無包膜之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與門靜脈癌栓、腫瘤細胞的分化程度之間的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　在正常肝組織、肝癌癌旁組織中SIRT3呈高表達;在肝癌組織中SIRT3

6、呈低表達或缺失提示在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了一定的作用。
　　第二章SIRT3基因真核表達載體的構(gòu)建及鑒定
　　目的：
　　構(gòu)建SIRT3真核表達載體并轉(zhuǎn)染HepG2細胞株,確定下步試驗的最佳時間點。
　　方法：
　　以臨床獲取的正常肝組織mR NA為模板,通過RT-PCR方法獲得SIRT3基因全長序列,將其克隆連接pZsGreen-c1載體,進行序列、雙酶切鑒定。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌H

7、epG2細胞株中。將細胞株分為三組:pZsGreen-c1-SIRT3 HepG-2組(實驗組)、pZsGreen-c1 HepG2組(實驗對照組)和HepG2N胞(空白對照組),通過Western-blotting試驗方法檢測轉(zhuǎn)染0h、24h、48h、72h、96h后,各組細胞中SIRT3的表達情況,并確定下一步最佳實驗時間。
　　結(jié)果：
　　成功構(gòu)建了真核表達載體pZsGreen-c1-SIRT3,并將其轉(zhuǎn)染至HepG2

8、細胞株。Westem-blotting檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染48h后pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2細胞株中SIRT3蛋白的表達水平明顯高于pZsGreen-c1HepG2組和HepG2組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),轉(zhuǎn)染后72小時為下一步實驗的實驗時間點。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建pZsGreen-c1-SIRT3的真核表達質(zhì)粒并鑒定。
　　第三章SIRT3抑制HepG2作用的初步研究
　　目的

9、：
　　觀察pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2細胞株的增殖和調(diào)亡,并研究其初步作用機制。
　　方法：
　　采用RT-PCR、Western-blotting實驗方法檢測HepG2、LO2細胞株的SIRT3 mRNA及蛋白的表達水平的表達;采用MTT實驗觀察pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2、pZsGreen-c1 HepG2和HepG2三組細胞株的生長、增殖;AnnexinV/PI雙標測三組細胞

10、株的凋亡率。采用RT-PCR和Western-blotting實驗方法檢測pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2細胞株、pZsGreen-c1 HepG2細胞株和HepG2細胞株中SIRT3、Fas、Bax、P53 mRNA及蛋白的表達水平和WST-1方法檢測三組細胞株中MnSOD含量。
　　結(jié)果：
　　1、RT-PCR和Western-blotting實驗LO2細胞株中SIRT3表迭量較HepG2細胞株的表達水平明

11、顯增高,兩組細胞株比較之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、MTT實驗結(jié)果pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2、pZsGreen-c1HepG2和HepG2三組細胞株的OD值隨培養(yǎng)時間延長,OD值逐漸升高,呈時間依賴性,C組與A、B組細胞株培養(yǎng)48小時后不同時間點OD值、抑制率之間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。三組細株培養(yǎng)48小時候不同時間點的OD值及抑制率之間比較的結(jié)果提示pZsGreen-c1

12、HepG2細胞株生長受到了明顯的抑制,且pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2細胞株培養(yǎng)48小時后的抑制率隨培養(yǎng)時間的延長,而抑制率升高,呈時間依賴性。
　　3、AnnexinV/PI雙標測三組細胞株凋亡率比較:pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2細胞組早期和晚期凋亡細胞期細胞,相對于pZsGreen-c1 HepG2和HepG2兩組細胞株都明顯增多,具有顯著性差異(P＜0.01)。
　　4、RT-PCR

13、an Western-blotting實驗pZsGreen-c1 HepG2和HepG2兩組細胞株中SIRT3、p53、Bax、Fas表達量二者之間無顯著性差異( P＞0.05),pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2細胞組中SIRT3、p53、Bax、Fas表達水平明顯增加,它們的表達水平與pZsGreen-c1 HepG2和HepG2兩組細胞株比較之間顯著性差異(P＜0.01)。
　　5、WST-1法檢測了三組細胞株中

14、MnSOD的含量,其中pZsGreen-c1 HepG2和HepG2兩組細胞株中MnSOD含量二者之間無顯著差異性(P＞0.01);pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2細胞組中MnSOD的含量較其他組的含量明顯增加,與pZsGreen-ct HepG2和HepG2兩組細胞株比較之間有顯著性差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、pZsGreen-c1-SIRT3具有抑制HepG2細胞株的生長增殖,誘導(dǎo)HepG2

15、細胞株的凋亡的作用;
　　2、其可能的作用機制是SIRT3高表達上調(diào)MnSOD和p53的表達水平,及MnSOD上調(diào)Bax、FaS來誘導(dǎo)細胞凋亡。
　　總結(jié)論：
　　1、在正常肝組織、肝癌癌旁組織中SIRT3呈高表達,在肝癌組織中SIRT3呈低表達或缺失;提示SIRT3在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了一定的作用;
　　2、成功構(gòu)建pZsGreen-c1-SIRT3的真核表達質(zhì)粒并鑒定;
　　3、pZsGreen-