HBsAg在原發(fā)性肝癌中的表達特點及臨床相關性研究.pdf

1、研究背景:
　　原發(fā)性肝細胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率具有逐漸上升趨勢,乙型肝炎是導致原發(fā)性肝癌的最重要原因。
　　HBsAg在肝癌中的表達情況一直有學者在研究。通過對原發(fā)性肝癌組織、癌旁組織研究,結果一般都認為肝癌組織中HBsAg陽性率相對癌旁組織要明顯降低。我們推測原因,除了在基因和轉錄水平控制HBsAg的表達,肝癌細胞還可能在翻譯后加工水平調

2、節(jié)HBsAg的結構和抗原特性。換言之,肝癌細胞分泌的HBsAg的翻譯后修飾或空間構象發(fā)生改變,導致免疫原性改變,腫瘤從而逃逸宿主的免疫反應。如果有一種特異性抗體只結合肝癌細胞分泌的結構發(fā)生變化的HBsAg,特別是在肝癌細胞膜上表達的HBsAg,那么針對HBsAg的乙肝相關性肝癌免疫治療就會取得突破性進展。目前還有研究報道HBsAg在癌旁組織中的表達特征可能會和肝癌診斷和預后相關。
　　研究目的:
　　為了驗證以上推測,我們計

3、劃制備HBsAg單克隆抗體,利用流式細胞技術、ELISA方法和免疫組化方法來檢測這些抗體的結合能力和結合特點,以期能發(fā)現(xiàn)特異性識別肝癌細胞膜上的HBsAg的抗體。同時我們還可以利用制備的抗體來分析肝癌組織和癌旁組織HBsAg不同表達特點,結合臨床資料,尋找HBsAg表達特點與肝癌預后之間的相關性,為臨床預測肝癌復發(fā)風險提供新的標志物。
　　材料和方法:
　　1.單克隆抗體的制備和檢測,利用已有的HBsAg免疫Balb/c小鼠

4、,應用雜交瘤技術制備單HBsAg單克隆抗體。應用ELISA,流式細胞檢測技術檢測所獲抗體。
　　2.篩查抗體在肝癌標本中的表達特性:選取手術切除的肝癌組織標本,用14種雜交瘤上清分別與之進行免疫組化和流式細胞學檢測,初步分析每個抗體在人肝癌手術標本中的表達特征。
　　3.分析肝癌的臨床病理預后。實驗收集2007年1月-2009年6月解放軍總醫(yī)院乙肝相關性原發(fā)性肝癌患者手術切除蠟塊標本,共42例。每個標本均包括癌組織及癌旁組織

5、且臨床資料完整。選取經過腹水純化后的抗體,對標本進行免疫組化實驗,檢驗不同抗體HBsAg的檢出率是否有差別;將患者按照腫瘤大小、AFP高低、有無門靜脈癌栓、分化程度、HBV-DNA水平、單多發(fā)癌灶、癌旁組織GGHⅠ表達水平、癌旁組織GGHⅡ表達水平進行分組進行生存分析,比較組別之間復發(fā)時間和生存時間有無差別;利用COX模型找出與肝癌復發(fā)和生存相關的危險因素。
　　結果:
　　1.單克隆抗體制備:應用雜交瘤技術,我們獲得了14

6、個單克隆雜交瘤細胞,對雜交瘤上清進行ELISA和流式細胞學檢測后,選取12種雜交瘤分別注射小鼠腹腔獲得腹水,經過純化后,我們獲得了5種高濃度腹水抗體。
　　2.篩查抗體的特性:根據(jù)免疫組化結果,我們將抗體分為4種類型:1、癌旁組織著色強于癌組織;2、癌組織表達與癌旁組織著色均比較顯著;3、癌旁肝細胞和癌細胞核著色;4、肝癌細胞膜著色。針對HepG2.215細胞流式細胞學檢測結果顯示有3種抗體表達為陽性結果。挑選出具有代表性的第一類

7、4號和第二類2號純化腹水進行下一步實驗。
　　3.2種抗體的檢出率:2號、4號抗體在癌組織中HBsAg檢出率分別為19.04％和16.66%,在癌旁組織中檢出率分別為73.81%和71.42%。經統(tǒng)計學檢驗,2種抗體在癌旁組織和肝癌組織中HBsAg檢出率無統(tǒng)計學差異。
　　4.生存分析:腫瘤大小組之間、AFP高低組之間、有無癌栓組之間、2AbGGHⅡ高低組之間、4AbGGHⅡ高低組之間復發(fā)時間和生存時間均有顯著差異。(P<0