大鼠戊四唑點燃癲癇模型認知障礙形成的內(nèi)在機制以及草果知母湯的干預(yù)作用.pdf

1、目的：人類的認知功能涉及學(xué)習(xí)能力、記憶力、注意力及智力等方面，彼此關(guān)系密切，互有影響。癲癇因其病程長、難根治、病因復(fù)雜、發(fā)病機理不明確，是中醫(yī)常見疑難病證之一，亦被西醫(yī)學(xué)列為現(xiàn)代難治病。該病具有反復(fù)發(fā)作的特點，長期發(fā)作對高級神經(jīng)機能損害作用較大，尤其可致智力障礙。癲癇患者的智力障礙，主要取決于腦損害程度，表現(xiàn)為認知功能的損害，包括記憶受損、智能下降以及注意力的障礙等。近年來，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，臨床研究發(fā)現(xiàn)，癲癇的發(fā)作類型和常規(guī)抗癲癇藥均可

2、對癲癇患者的認知功能造成損害，并且發(fā)作的頻率、類型越嚴重，用藥的劑量越大，認知功能的損害程度越重。由于癲癇患者往往存在發(fā)作和用藥并存的情況，目前的研究不能就癲癇發(fā)作和抗癲癇藥在認知損害中的作用做出確切的評價，本實驗旨在用實驗研究的方法，利用動物模型，模擬臨床以上兩種致病因素并進行嚴格控制，從而準確評價癲癇患者認知障礙形成因素的作用，從而指導(dǎo)醫(yī)生和患者對其最嚴重的引發(fā)因素做出選擇性回避。 目前尚無專門針對改善癲癇患者認知障礙的藥物

3、。由于中藥復(fù)方不同性質(zhì)藥味的配伍，使其能發(fā)揮多環(huán)節(jié)的整合、調(diào)節(jié)作用，因此，在認知障礙的治療領(lǐng)域有獨特的優(yōu)勢，其療效和挖掘余地遠遠的大于化學(xué)藥物。草果知母湯源自吳鞠通《溫病條辨》，是王洪圖教授以“脾胃主神志”、“脾胃轉(zhuǎn)樞為五臟藏神關(guān)鍵”理論為指導(dǎo)，從調(diào)理脾胃入手，治療癲癇的經(jīng)方驗方。在既往大量的臨床和實驗研究中，我們發(fā)現(xiàn)，草果知母湯對癲癇患者和動物的認知功能亦有明顯的改善作用，可以明顯提高患兒的學(xué)習(xí)成績以及癲癇動物模型的空間記憶力。本實驗

4、旨在通過實驗的方法，近一步確定草果知母湯改善由于驚厥反復(fù)發(fā)作與大劑量苯妥英鈉應(yīng)用導(dǎo)致大鼠認知障礙的療效作用，并闡明草果知母湯阻斷認知障礙形成的內(nèi)在機理。 方法：(1)利用戊四唑(pentylenetrazol，PTZ)點燃癲癇模型大鼠，分別施以反復(fù)點燃誘發(fā)驚厥高頻發(fā)作和大劑量苯妥英鈉灌胃，通過學(xué)習(xí)、記憶等行為測試，評價二者導(dǎo)致認知損傷程度的不同；觀察以上兩種因素所導(dǎo)致的認知損傷的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)海馬的病理形態(tài)學(xué)變化；用免疫組化法測定與認

5、知活動關(guān)系最密切的中樞認知基因cAMP反應(yīng)單元結(jié)合蛋白(cAMPresponseelement-bindingprotein，pCREB)和即刻早期基因c-fos表達的不同，以闡明二者發(fā)生機制的差異。(2)觀察草果知母湯阻斷由于驚厥反復(fù)發(fā)作與大劑量苯妥英鈉導(dǎo)致大鼠認知障礙在行為學(xué)、形態(tài)學(xué)上的改變，以闡明草果知母湯對其認知行為的改善作用的內(nèi)在機理。 結(jié)果：(1)實驗一部分分別使用PTZ反復(fù)誘導(dǎo)點燃和大劑量抗癲癇一線藥物苯妥英鈉兩種

6、方法處理后的大鼠，用Morris水迷宮來檢測其空間學(xué)習(xí)記憶成績的變化，發(fā)現(xiàn)每日發(fā)作組和苯妥英鈉大劑量組同PTZ模型組比較學(xué)習(xí)能力下降較大，故作為障礙模型組篩選出來。單從水迷宮的行為學(xué)檢測結(jié)果來看，每日發(fā)作組大鼠的認知損害程度最大，苯妥英鈉大劑量組次之，隔日發(fā)作組再次，苯妥英鈉小劑量組最小。 (2)實驗二中，用免疫組化和Westernblotting方法觀察經(jīng)過實驗一處理后的大鼠海馬結(jié)構(gòu)中，與認知功能有密切關(guān)系的兩種蛋白，即磷酸化

7、的c-AMP反應(yīng)單元結(jié)合蛋白(phosphorylatedc-AMPresponseelement-bindingprotein，pCREB)和c-fos蛋白的表達，隨著癲癇發(fā)作頻率的增加和抗癲癇藥物劑量的增大，pCREB在大鼠海馬中有下降的趨勢，并且其含量與癲癇發(fā)作頻率和抗癲癇藥物劑量成反比；c-fos蛋白在大鼠海馬中有增高的趨勢，并且其含量與癲癇發(fā)作頻率和抗癲癇藥物劑量成正比。各組間經(jīng)過比較，癲癇反復(fù)發(fā)作組和苯妥英鈉劑量組與正常組比

8、較變化顯著，從分子機制角度說明了這兩種處理方法確實對大鼠的認知功能造成了損害。從pCREB和c-fos蛋白表達檢測結(jié)果來看，每日發(fā)作組大鼠的認知損害程度最大，苯妥英鈉大劑量組次之，隔日發(fā)作組再次，苯妥英鈉小劑量組最小，提示癲癇高頻發(fā)作較單純抗癲癇藥物對大鼠認知功能的損害作用更大，這與實驗一部分中動物行為學(xué)檢測結(jié)果相吻合。 (3)在實驗三中，通過一段時間藥物治療后的實驗結(jié)果來看，大鼠海馬部位的pCREB有上調(diào)的趨勢，并且c-fos

9、蛋白表達明顯下調(diào)，提示草果知母湯對于由PTZ反復(fù)誘發(fā)導(dǎo)致的認知障礙和由大劑量抗癲癇藥物引起的認知障礙均有一定的反轉(zhuǎn)作用。但與對照西藥尼莫地平比較，兩者的差別未能顯現(xiàn)。 結(jié)論：癲癇高頻率發(fā)作和抗癲癇藥物均可對大鼠認知功能造成損害影響，并且損害程度隨癲癇發(fā)作頻率的增高和抗癲癇藥物的劑量的增大而加重。比較這兩種影響大鼠認知功能的因素，癲癇高頻發(fā)作較單純抗癲癇藥物的損害作用更大。草果知母湯確實能夠緩解在癲癇發(fā)作和治療過程種出現(xiàn)的認知損害