白眉蝮蛇去整合素Adinbitor在畢赤酵母中的表達(dá)及對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用.pdf

1、去整合素(disintegrins)為一組源于出血性蛇毒的抗黏附蛋白質(zhì)的總稱，因其可強(qiáng)力拮抗整合素(integrin)而得名。其特征為：富含半胱氨酸，并多含有Arg-Gly-Asp(RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)親水性氨基酸序列，分子量?jī)H為5～9kD，多為單鏈蛋白分子[1]。因?yàn)榇蟛糠旨?xì)胞整合素(integrins)都能識(shí)別RGD序列，而大多數(shù)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)蛋白成分都含有RGD序

2、列，因此去整合素可憑借其RGD識(shí)別序列而成為細(xì)胞外基質(zhì)與整合素間結(jié)合的強(qiáng)有力的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，從而抑制整合素參與的多種生理活動(dòng)。 去整合素(Adinbitor)是運(yùn)用基因工程手段，從產(chǎn)于中國(guó)旅順的白眉蝮蛇(Gloydius blomhoffi brevicaudus)毒腺中獲得。即從中國(guó)白眉蝮蛇毒腺中提取總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，根據(jù)NCBI上發(fā)表的同源序列反推DNA，自行設(shè)計(jì)引物，獲得了219 bp的白眉蝮蛇去整合素基因。去

3、整合素(Adinbitor)由73個(gè)氨基酸殘基組成，含有12個(gè)半胱氨酸殘基和一個(gè)去整合素特征性RGD三肽識(shí)別序列，相對(duì)分子量9KD，作為去整合素家族的新成員，可作為多種整合素受體的強(qiáng)有力的拮抗劑，具有抑制腫瘤的作用。 整合素(Integrins)是廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞表面的一類細(xì)胞黏附分子，它介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間及細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用，參與細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞，在細(xì)胞分化，胚胎發(fā)育，凝血，組織修補(bǔ)及細(xì)胞黏附，侵襲等各方面起重要作

4、用。整合素與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，整合素可通過傳遞特定的信號(hào)或誘導(dǎo)基因表達(dá)來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的黏附，增殖，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，凋亡以及腫瘤血管的生成等。所有去整合素都具有其生物學(xué)活性所必須的RGD特異性識(shí)別序列，憑借此序列去整合素可作為多種整合素受體的強(qiáng)有力的拮抗劑，抑制整合素在腫瘤發(fā)生過程中的各種作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)去整合素能夠抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)纖連蛋白，玻連蛋白，層粘連蛋白和膠原的黏附，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，同時(shí)去整合素還具有誘導(dǎo)

5、腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的特異作用。 酵母作為一種后起的外源表達(dá)系統(tǒng)，由于兼具原核及真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)，正在基因工程領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，目前研究比較成熟的是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastors，P.pastoris)。畢赤酵母是一種單細(xì)胞真核生物，近十年來被作為真核表達(dá)系統(tǒng)而用于外源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。其表達(dá)的Adinbitor在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然Adinbitor，有利于大量生產(chǎn)。 本論文將已經(jīng)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPIC9

6、K-Adinbitor在畢赤酵母GS115中表達(dá)的去整合素(rAdinbitor)，經(jīng)過層析柱純化及透析，獲得分子量為9KD的去整合素(rAdinbitor)，并對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞的黏附，增殖，浸潤(rùn)，轉(zhuǎn)移和凋亡方面進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rAdinbitor同樣可以抑制腫瘤細(xì)胞的黏附，增殖，浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移，同時(shí)還可以呈劑量依賴性方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。 總之，本論文成功的通過基因工程手段從中國(guó)旅順的白眉蝮蛇毒腺中獲得了一個(gè)去整合素