蛇源去整合素Adinbitor對Integrin α-,V-β-,3-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響.pdf

1、蛇毒是自然界最復(fù)雜的天然毒性蛋白混合物之一，具有非常廣泛的生物活性，很早就引起國內(nèi)外科學(xué)工作者的注意。去整合素(disintegrins)為一組源自于出血性蛇毒的抗黏附蛋白質(zhì)的總稱，因其可強(qiáng)力拮抗整合素(integrin)而得名。其特征為：富含半胱氨酸，并多含有Arg-Gly-Asp(RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)親水性氨基酸序列，分子量僅為5～9kD，多為單鏈蛋白分子。此蛇毒蛋白家族可憑借其分子中RGD序列而成為細(xì)胞外基質(zhì)

2、(ECM)與細(xì)胞整合素間結(jié)合的強(qiáng)有力的競爭性拮抗劑；因RGD模體能被血小板纖維蛋白原受體僅α<,IIb>β<,3>識別，其還具有抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的作用。因此，去整合素可運(yùn)用于與細(xì)胞黏附相關(guān)的疾病研究領(lǐng)域，如血管新生、腫瘤轉(zhuǎn)移、血栓癥等。關(guān)于去整合素的功能研究，國內(nèi)外已有的相關(guān)報道為：臺灣的Rhodostomin<'[1]>和Accutin<'[2]>、韓國的Salmosin<'[3，4]>和Saxatilin<'[5]>、美國

3、的C0ntortrostatin<'[6]>等，這些取自于蛇毒的去整合素均具有抑制血管新生與腫瘤轉(zhuǎn)移，抑制血小板聚集等功效<'[1-9]>。 整合素為一細(xì)胞表面受體的異源二聚體家族，是一組跨膜糖蛋白，迄今為止已知有18種不同的α亞基和8種不同的β亞基組成至少24種的異源二聚體<'[11-12>。α及β亞基的N末端(胞外端)共同構(gòu)成配體結(jié)合位點(diǎn)。因為大部分細(xì)胞整合素都識別RGD氨基酸順序，而大多數(shù)ECM蛋白都含有RGD順序，所以R

4、GD序列已被公認(rèn)為是ECM成分與細(xì)胞整合素結(jié)合的位點(diǎn)<'[13]>。整合素胞內(nèi)部分較短，但可以通過α-輔肌動蛋白(α-actinin)、踝蛋白(talin)和黏著斑蛋白(vinculin)與細(xì)胞骨架相連。整合素主要介導(dǎo)細(xì)胞之間及細(xì)胞與ECM之間的黏附，并介導(dǎo)細(xì)胞與ECM之間的雙向信號傳導(dǎo)，對細(xì)胞的黏附、增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡起到重要的調(diào)控作用，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用<'[14]>。整合素儀αvβ3是其中的一種重要分子。許多研究表

5、明，整合素α<,v>β<,3>與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。在整合素活化和聚集成簇的位點(diǎn)，蛋白質(zhì)聚集成黏著斑復(fù)合體而與細(xì)胞內(nèi)表面相連。這些復(fù)合體是細(xì)胞應(yīng)答周圍環(huán)境而產(chǎn)生張力的位點(diǎn)，其可以使細(xì)胞改變形狀并實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的細(xì)胞遷移和細(xì)胞分裂等過程<'[10]>。目前看來，整合素的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是酪氨酸磷酸化級聯(lián)反應(yīng)。整合素α<,v>β<,3>與配體結(jié)合后，早期是通過使黏著斑激酶(foeal adhesion kinase，F(xiàn)AK)酪氨酸磷酸化而使其激活，

6、活化的FAK激活胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如JNK、p38MAPK、Ras-MAPK。引發(fā)其他細(xì)胞骨架蛋白和信號蛋白的酪氨酸磷酸化，這些磷酸蛋白對調(diào)節(jié)細(xì)胞功能起重要作用。因此，F(xiàn)AK被認(rèn)為是整合素依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基礎(chǔ)分子，在整合素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著至關(guān)重要的作用<'[15]>；整合素α<,v>β<,3>與配體結(jié)合后，還可激活整合素連接激酶(ILK)，促進(jìn)細(xì)胞周期循環(huán)的進(jìn)行，抑制細(xì)胞的凋亡<'[16]>。 目前研究較清楚的

7、是Ras-MAPK通路。FAK有6個磷酸化位點(diǎn)(Tyr397，407，576，577，681，925)，它們是FAK發(fā)揮傳導(dǎo)功能的關(guān)鍵部位<'[17]>。FAK自身磷酸化位點(diǎn)與src家族相互作用，使體外FAK激酶活性增加到最大限度，出現(xiàn)Grb<,2>活性位點(diǎn)，再與SOS結(jié)合，進(jìn)入Ras-MAPK通路<'[181]>。 由此可見，阻斷整合素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，將引起一系列細(xì)胞生理活動的改變。而蛇源去整合素因其可強(qiáng)力拮抗整合素?zé)o疑會在其

8、中扮演重要角色。鑒于以往對整合素功能及作用機(jī)制的相關(guān)報道，本文對產(chǎn)于中國旅順的白眉蝮蛇去整合素進(jìn)行了研究。 本實(shí)驗室已經(jīng)從產(chǎn)于中國旅順的白眉蝮蛇(Gloydius blomhoffibrevicaudus)毒腺中提取出總RNA，利用自行設(shè)計的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得了219bp的白眉蝮蛇去整合素基因。測序結(jié)果顯示，其與韓國的蝮蛇去整合素的saxatilin的同源性最高：DNA序列同源性為95.8﹪，蛋白質(zhì)序列同源性為 91

9、.8﹪，且蛋白質(zhì)中含有去整合素的特征模體RGD及 12 個半胱氨酸。將此去整合素基因進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化與誘導(dǎo)后，得到了該蛋白的可溶性高效表達(dá)。經(jīng)組氨酸親和層析純化，獲得了分子量為9kD的均質(zhì)蛋白，并將其命名為Adinbitor。 本文在上述研究成果的基礎(chǔ)上，對蛇源去整合素Adinbitor的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。主要做了以下幾方面的工作： 1．將已成功構(gòu)建的重組表達(dá)菌BL21/pET23b-adinbitor進(jìn)行IPTG

10、誘導(dǎo)表達(dá)：將可溶性蛋白成分經(jīng)組氨酸親和層析柱對其進(jìn)行純化，行Tricine-SDS PAGE對蛋白鑒定，成功獲得了分子量為9kD的均質(zhì)蛋白rAdinbitor。每升誘導(dǎo)培養(yǎng)物可獲3.6mg純化的rAdinbitor. 2.rAdinbitor劑量依賴性抑制C6細(xì)胞增殖的試驗結(jié)果表明：rAdinbitor與抗αvβ<,3>單克隆抗體的作用類似，提示rAdinbitor的作用位點(diǎn)可能是整合素αvβ<,3>；rAdinbitor抑制C6細(xì)胞增

11、殖的半數(shù)抑制濃度(medianinhibitory concentration，IC<,50>)為2.75μmol/L。rAdinbitor作用C6細(xì)胞的Caspase-3(胱天蛋白酶-3)——細(xì)胞凋亡蛋白水解酶表達(dá)量分析，rAdinbitor很可能通過Caspase-3途徑誘導(dǎo)C6細(xì)胞發(fā)生凋亡。 3.通過rAdinbitor對FAK-Ras-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中FAK、Ras、MEK、ERK各激酶表達(dá)及磷酸化的結(jié)果表明，r

12、Adinbitor可有效抑制FAK表達(dá)及磷酸化；對Ras的表達(dá)成促進(jìn)作用：而對MEK、ERK的表達(dá)則為劑量性抑制作用。這充分證明rAdinbitor的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是通過抑制整合素avl3 3的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)的，通過封閉ECM與整合素的作用位點(diǎn)，阻止黏著斑形成對整合素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起阻滯作用，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡等一系列反應(yīng)。 總之，本論文成功獲得了rAdinbitor純化蛋白，并較為系統(tǒng)的對FAK-Ras-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行