G6PD-6PGD酶活性直接比值法實驗優(yōu)化探討.pdf

1、紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥是人類最常見的遺傳性酶缺陷病，呈X染色體連鎖不完全顯性方式遺傳，全世界約有2-4億人受累，我國分布呈“南高北低”的趨勢?；颊吲R床表現(xiàn)變化大，從無癥狀到新生兒黃疸、藥物或感染造成的急性溶血、蠶豆病和重癥慢性非球形紅細胞溶血性貧血（CNSHA），嚴重者導(dǎo)致新生兒期重癥核黃疸，造成死亡或永久性神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。該病的及早診斷和預(yù)防是我國優(yōu)生優(yōu)育工作的一個重要組成部分，檢測是否存在G6PD缺乏，給患者

2、合理的忠告，避免使用可能引起溶血的藥物，合適處理由此引起的新生兒高膽紅素血癥，是該病的重點。 G6PD缺乏癥的分子基礎(chǔ)是基因突變，G6PD基因位于Xq28，由13個外顯子及12個內(nèi)含子組成，全長20kb，是一典型的看家基因。隨著G6PD基因結(jié)構(gòu)的闡明和分子檢測技術(shù)的發(fā)展，新的突變類型被不斷發(fā)現(xiàn)。迄今世界上已報道140多種，G6PD基因突變具有以下特點：多為單個堿基置換的錯義突變；大多數(shù)基因突變屬于轉(zhuǎn)化型突變，常發(fā)生在CpG二核

3、苷酸內(nèi)的C-T的轉(zhuǎn)換；具有種族和地區(qū)異質(zhì)性；尚未發(fā)現(xiàn)整個基因或大片段基因的缺失，也未見無義突變及移碼突變；除外顯子Ⅰ外，基因突變遍及其余外顯子；具有復(fù)合突變。 迄今為止，在中國人中共發(fā)現(xiàn)17種G6PD基因突變類型。它們分別是：A95G、G392T、G487A、A493G、T517C、C519T、C592T、A835G、A835T、G87lA、C1004T、C1024T、G1360T、G1376T、G1381A、C1387T、G1

4、388A。不同地區(qū)人群基因突變類型和發(fā)生頻率不同，同一地區(qū)不同民族基因突變類型也不同。資料表明，G6PD基因外顯子上的G1376T和G1388A是中國人群G6PD缺乏者最常見的基因突變類型，其次為A95G和C1024T。在南方地區(qū)，如廣東、廣西、海南省G1376T、G1388A、A95G這三種突變占75.6％以上，G392T、C592T、G871A、C1024T這四種突變占10％-20％左右，其他稀少突變和未知突變占20％，因此G6PD

5、缺乏在特定地區(qū)有熱點突變類型，同時尚有相當比例的基因突變未被發(fā)現(xiàn)。 常規(guī)的基因診斷方法，如等位基因特異性擴增（ARMS），錯配堿基聚合酶鏈反應(yīng)/限制內(nèi)切酶圖譜分析（miswatch-PCR/RE）、等位基因寡核苷酸探針雜交（ASO）等方法用于檢測已知突變，聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（PCR-SSCP）、變性梯度凝膠電冰（DGGE）、溫度梯度凝膠電冰（TGGE）等方法用于檢測未知突變。但均存在檢測效率低、漏檢率高，不能確定基

6、因型等不足。 變性高效液相色譜（DHPLC）是近年來發(fā)展起來的一種新的核苷酸檢測技術(shù)，是分離核苷酸片段及分析檢測已知基因突變核單核苷酸多肽性（SNP）的最佳技術(shù)，為檢測突變和SNP提供新的檢測平臺，DHPLC可以高通量、敏感而準確地檢測已知DNA變異、發(fā)現(xiàn)新突變或多態(tài)性，自動化程度高，檢測結(jié)果以圖表顯示，直觀易判斷，但技術(shù)復(fù)雜、費用昂貴、耗時長，只用于科學研究，目前尚難以在臨床醫(yī)院推廣使用。 目前檢測G6PD缺乏癥常用的

7、篩查方法有:①高鐵血紅蛋白還原試驗法（MHBRT），該方法優(yōu)點在于不需要昂貴的試劑或儀器，操作簡單，可用于普查,但存在假陽性；②熒光斑點法，該方法的優(yōu)點是操作簡單，假陽性低，缺點是需長波紫外光燈及氧化型谷胱甘肽（GSSG），判斷結(jié)果受主觀因素影響大；③硝基四氮唑藍法（NBT），該方法只需使用普通的可見光光度計且試劑用量少；④高鐵血紅蛋白還原試驗微量組織化學洗脫法（MHBRT），該方法優(yōu)點是對雜合子的檢出率特別有效，但作為篩查法則過于繁瑣

8、，不適于臨床常規(guī)使用。前三種方法對于G6PD正常、女性純合子、男性半合子的靈敏度和特異度均很高，但對于女性雜合子檢出率較低，分別為50％，30％，40％。即使是目前國際公認的G6PD缺乏癥的確診方法——G6PD/6PGD酶活性直接比值法（UVST）對于女性雜合子檢出率也只有69.1％。能否通過改良優(yōu)化現(xiàn)有實驗方法提高對G6PD缺乏癥尤其是女性雜合子的檢出率進而提高對G6PD診斷的靈敏度呢?鑒于目前國內(nèi)外少有對于該方面的研究，嘗試性對目前

9、國際公認的G6PD/6PGD酶活性直接比值法進行了試探性的改良優(yōu)化和對比試驗研究，并獲得了可喜的結(jié)果。 目的:探討采用不同的取樣方法對國際公認的G6PD/6PGD比值法進行改良優(yōu)化，并分別把兩種改良方法（分別命名為改良方法B、改良方法C）與現(xiàn)用常規(guī)方法（方法A）對雜合子的檢測進行對比研究，進而對改良方案做出評價，以提高女性G6PD雜合子的檢出率，減少漏診。 方法:從廣東省人民醫(yī)院病房和門診送檢的G6PD標本中抽取200例

10、，每份標本分別用國際公認的G6PD/6PGD比值法以及兩種改良的G6PD/6PGD比值法進行檢測，雙盲法與PE/DHPLC診斷結(jié)果進行對比，分析兩種改良方法與常規(guī)方法對G6PD缺乏癥檢測結(jié)果及診斷結(jié)果的差異、符合率，總結(jié)三種方法對G6PD缺乏癥雜合子的檢出率。 結(jié)果:改良方法B的G6PD/6PGD比值、對疾病的診斷與常規(guī)方法A存在顯著差異，靈敏度較常規(guī)方法A高；改良方法C的G6PD/6PGD比值、對疾病的診斷與常規(guī)方法A存在顯著

11、差異（t=17.141，p<0.05），靈敏度亦較常規(guī)方法A高。PE/DHPLC檢測（特別是家系調(diào)查）結(jié)果表明改良方法C對女性雜合子的檢出率為98％，常規(guī)方法A對女性雜合子的檢出率為79.5％，改良方法B為92.0％。實驗結(jié)果提示：改良方法C對于雜合子的檢出率高于常規(guī)方法A與改良方法B。 結(jié)論：對國際公認的G6PD/6PGD比值法進行改良的方法C（以成熟紅細胞加蒸餾水溶血）可提高G6PD女性雜合子的檢出率，有望成為解決G6PD女