鹽酸小檗堿對G6PD酶缺陷患者紅細胞的影響.pdf

1、背景與目的：
　　 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)缺乏癥是一種紅細胞酶的缺陷病。它被發(fā)現(xiàn)在半世紀以前,是最常見的性連鎖遺傳疾病之一,據(jù)統(tǒng)計全球約四億人患有此病,本癥常在瘧疾高發(fā)區(qū)、地中海貧血和異常血紅蛋白病等流行地區(qū)出現(xiàn)。我國華南及西南各省、自治區(qū)(廣東、廣西、云南及四川)等地為高發(fā)區(qū),據(jù)報道廣東省G6PD缺乏癥的發(fā)生率在6％左右?；颊叱Ｔ诩毙愿腥?、進食蠶豆

2、或接觸氧化性藥物等誘因下發(fā)病。發(fā)病時臨床表現(xiàn)為急性溶血性貧血和由此而產(chǎn)生的高膽紅素血癥,是引起新生兒高膽紅素血癥,甚至不可逆性膽紅素腦病或核黃疸的重要原因之一。
　　 黃連是常用中藥,其藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,味苦,性寒,有瀉火、解毒、清熱、燥濕的功能?，F(xiàn)代研究表明黃連主要含生物堿,以小檗堿(即黃連素Berberine)為主要成分。黃連具有多方面的藥理作用,包括抗菌、抗病毒、抗原蟲、抗真菌、抗腹瀉、抗腦缺血、抗炎、免疫調節(jié)作用

3、、甚至有抗?jié)?、抗癌等功效。中醫(yī)自古有給新生兒服用黃連的黃連法,清朝皇室有給新生兒服用含黃連的福壽丹開口的傳統(tǒng)。至今,安徽、湖南、江西、四川、福建、廣東、廣西、臺灣等南方諸省民間仍有給新生兒服用黃連方劑的習慣。
　　 新加坡黃學文教授在研究新生兒核黃疸病的過程中發(fā)現(xiàn),華族新生兒黃疸發(fā)病率明顯高于白種人,同時,發(fā)現(xiàn)這些新生兒或他們的母親在圍產(chǎn)期曾有服用黃連等中藥的病史,聯(lián)想到二次世界大戰(zhàn)期間美軍黑人為防治瘧疾服用伯氨喹啉等藥而引起

4、急性溶血的病理過程,由此認為黃連等中藥可能屬于氧化劑藥物,有誘發(fā)6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)缺陷的新生兒發(fā)生溶血性黃疸的可能。為此,新加坡衛(wèi)生部于1978年10月6日宣布:新加坡全國禁止使用和買賣黃連及含小檗堿的藥物。同時新加坡藥物咨詢委員會要求,采用西醫(yī)方法進行科學實驗并提呈有科學根據(jù)的研究報告。
　　 此后,關于黃連等中藥是否會引起G6PD酶缺陷患者發(fā)生溶血這一課題進行了不少研究,但結果不一。
　　 我國學者林娜

5、研究發(fā)現(xiàn)治療劑量的黃連對正常大鼠離體血紅細胞滲透脆性沒有明顯影響；黃連和小檗堿對實驗性G6PD缺陷大鼠紅細胞滲透脆性也沒有明顯影響。給妊娠小鼠服用黃連和小檗堿,其胎仔血清總膽紅素(TBIL)、谷丙轉氨酶(ALT)、血紅蛋白定量,較對照組都沒有發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學差異,推測其不能引起溶血。香港大學兒科專家楊則認為,川黃連、牛黃、臘梅花、茵梔黃等中藥有加重新生兒黃疸的危險性。王磊等研究認為黃連能使G6PD酶缺乏合并痢疾感染(G6PD-BD)大鼠紅細

6、胞滲透脆性增加。廖華薇通過回顧性臨床分析研究報道孕產(chǎn)婦服用黃連可能有增加G6PD酶缺乏的新生兒發(fā)生急性溶血的可能性。而臺灣學者廖昌立等認為黃連不僅不會誘發(fā)溶血和發(fā)生新生兒高膽紅素血癥,相反具有一定的退黃作用,與記載的黃連利膽作用相符。Fok認為,黃連等中藥與正常和G6PD缺陷新生兒黃疸的發(fā)生無關,也不能治療和預防新生兒黃疸。
　　 目前對黃連是否會誘發(fā)G6PD缺陷患者發(fā)生溶血的研究結果不一,可能與研究對象及研究方法不一有關,也可

7、能與中藥制劑、劑量不同有關。例如:1、新生兒期臨床研究影響因素較多,可合并ABO溶血、感染、缺氧等；新生兒出生后有一個生理性溶血過程,紅細胞本身穩(wěn)定性差；另有報道稱新生兒期紅細胞G6PD酶穩(wěn)定性差,新生兒時期可能有一過性G6PD酶低下,至生后3個月可恢復正常。故采用新生兒紅細胞作為研究對象,影響因素較多。2、既往研究對象多以正常新生兒為主,缺乏對照組,G6PD缺乏患兒例數(shù)很少,缺乏統(tǒng)計學意義。3、實驗研究采用對紅細胞內G6PD活性有干擾

8、作用的強氧化劑乙酰苯肼藥物(APH)為造模藥,復制G6PD缺陷大鼠模型,但藥物造模與實際病人紅細胞有一定差距,且選擇研究指標為離體紅細胞滲透脆性,該指標敏感不夠。
　　 黃連為中藥材,產(chǎn)地不同、季節(jié)不同及提煉過程不同均可能影響其藥物有效成分含量,而鹽酸小檗堿(即黃連素)(Berberine,Ber)是黃連中發(fā)揮其核心藥理作用的主要成分,含量可達10％左右,其各項藥理指標穩(wěn)定、成熟,便于控制,傳統(tǒng)認為小檗堿口服吸收差,并有報道證實

9、這一點。李寶馨等研究發(fā)現(xiàn)家兔口服小檗堿50mg.kg-1,血漿峰濃度為92.7ug.L-1；寶麗華等研究發(fā)現(xiàn)健康人口服300mg小檗堿后血漿峰濃度達0.39mg.L-1；上世紀五十年代有人用熒光法進行測定,發(fā)現(xiàn)人口服鹽酸小檗堿0.4g,30min后,血中濃度為1 mg/L以下,但每隔4h連續(xù)服藥5次,血藥濃度不見升高。臨床上鹽酸小檗堿用量為0.1～0.3g,一日3次,因此按正常量口服鹽酸小檗堿后,其血漿峰濃度多小于1 mg/L。

10、　　 本實驗擬采用成人G6PD酶缺陷患者無病狀態(tài)下靜脈全血紅細胞為研究對象,采用鹽酸小檗堿作為實驗藥物,選擇四個藥物濃度,分別為0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L和5.0mg/L,覆蓋小劑量至超大劑量。觀察不同濃度鹽酸小檗堿對G6PD酶缺陷患者紅細胞形態(tài)、紅細胞計數(shù)、血漿游離血紅蛋白、G6PD酶活性的影響,探討鹽酸小檗堿誘發(fā)G6PD酶缺陷患者紅細胞發(fā)生溶血的可能性,以及藥物濃度與溶血的關系,試圖為黃連能否應用于G6PD酶活

11、性缺陷患者提供實驗依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.主要試劑和材料:本實驗所用鹽酸小檗堿(Berberine,Ber)標準品制劑購買于廣州市藥品檢驗所,批號110713-200911、鹽酸小檗堿用生理鹽水配成25mg/L、5mg/L、2.5mg/L、0.5mg/L的濃度,測定各濃度鹽酸小檗堿溶液PH值與滲透壓低溫保存?zhèn)溆?；G6PD酶活性定量檢測試劑盒購于廣州市科方醫(yī)療器械有限公司；鄰-甲聯(lián)苯胺法試劑購于汕頭市光華化學廠

12、；全血細胞分析儀型號:GY2-3000。
　　 2.研究對象:南方醫(yī)院門診查體中心,送檢G6PD酶活性測定的健康成人,年齡18-55歲,試劑盒正常參考值1.3～3.6KU/L,本研究設定G6PD酶活性低于1.2KU/L以下者納為實驗對象。G6PD下降者20例,G6PD酶活性范圍0.01～1.0KU/L(平均0.39±0.32KU/L),G6PD酶活性正常者20例,G6PD酶活性范圍1.93～3.15KU/L(平均2.93±0.3

13、0KU/L),取靜脈全血6ml,采用ACD抗凝。
　　 3.試驗分組:按血中鹽酸小檗堿的濃度不同分為4組,分別為:Ber0.1mg/L組、0.5mg/L組、1.0mg/L組、5.0mg/L組,以及藥物空白對照組(生理鹽水組)和陽性對照組(蒸餾水組)。將樣本分為六等份,每份800ul,分別加入生理鹽水配制的不同濃度的Ber200ul、生理鹽水和蒸餾水各200ul,加藥30分鐘后檢測各項指標。
　　 4.不同濃度Ber對紅細

14、胞形態(tài)的影響:
　　 取待檢全血一滴,置于載玻片上,推片。采用瑞士染色,并于10*40倍顯微鏡下觀察紅細胞形態(tài),照相機采圖。
　　 5.不同濃度Ber對紅細胞計數(shù)的影響:
　　 使用全血細胞分析儀,將待測樣本置于全血細胞分析儀吸液管下,按吸液按鈕,儀器自動生成結果。工作基本原理是利用兩端電極之間的壓力產(chǎn)生電脈沖,脈沖幅度的大小區(qū)分不同的細胞,而同幅度電脈沖進行計數(shù)就可得到顆粒的數(shù)量。
　　 6.不同濃度B

15、er對游離血紅蛋白的影響:
　　 游離血紅蛋白(Free Hemoglobin,FHb)是指血漿中血紅蛋白的量。通常血紅蛋白存在于紅細胞中,當紅細胞破壞,血紅蛋白釋放,即溶血發(fā)生時,血漿游離血紅蛋白增加。取離心后上層血漿為待檢血漿,采用鄰.甲聯(lián)苯胺法測定血漿游離血紅蛋白值,取3支試管,分別標明空白管、標準管、試驗管,按步驟加入實驗試劑,于435 nm比色,以空白管調零(相應濃度的鹽酸小檗堿溶液),讀取各溶液吸光度記為A值。游離血

16、紅蛋白(mg/L)=(At/As)*100(At為測定管A值,As為標準管A值)。
　　 6.1.不同濃度Ber分別對血漿和全血中血漿游離血紅蛋白的影響:
　　 預試驗結果發(fā)現(xiàn),全血中加入Ber后,血漿游離血紅蛋白水平不僅不升高,反而低于生理鹽水組,提示Ber可能有降低血漿游離血紅蛋白的作用,影響對溶血的判斷。試想如果全血中沒有紅細胞的破壞,血漿中游離血紅蛋白的量與全血中游離血紅蛋白的量相同,全血和血漿中分別加入鹽酸小檗

17、堿后,血漿游離血紅蛋白依然相同,因此作者將靜脈全血樣本分成10份,前5份直接加入不同濃度鹽酸小檗堿,另5份離心后取上層血漿,再在血漿中加入不同濃度鹽酸小檗堿,比較全血與血漿兩者血漿游離血紅蛋白水平的差異,檢測方法同前。
　　 6.2.加入Ber后血漿游離血紅蛋白水平的動態(tài)變化:
　　 預試驗結果發(fā)現(xiàn),加入鹽酸小檗堿后血漿游離血紅蛋白下降,為了解這種現(xiàn)象是短效或長效的影響,因此作者選Ber血中最終藥物濃度為5mg/L為加藥

18、濃度,分別于加藥后10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時檢測血漿游離血紅蛋白值,同時,不同時間點設空白藥物組做對照組,檢測方法同前。
　　 6.3.加藥6小時后不同濃度鹽酸小檗堿對血漿游離血紅蛋白的影響:
　　 預試驗結果發(fā)現(xiàn),Ber對血漿游離血紅蛋白測定影響在加藥6小時后消除,此時檢測有利了解血漿游離血紅蛋白值的原本狀況,故加藥后30分鐘離心分離血漿,將血漿置于4℃冰箱保存,6小時后檢測

19、血漿中游離血紅蛋白值,檢測方法同前。
　　 7.不同濃度Ber對G6PD酶活性的影響:
　　 G6PD酶活性定量檢測試劑中含葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate,G6P),待測樣品中G6PD酶催化G6P生成6-磷酸葡萄糖酸酯(6-phosphogluconate,6PG)同時將氧化型輔酶Ⅱ(NADP)變成還原型輔酶Ⅱ(NADPH),檢測340nm吸光度上升的速度,可以計算出樣品中G6PD的活性。用加樣

20、器精確吸取20ul壓積紅細胞加入1ml溶解液中,紅細胞完全溶解后,取20ul溶解液加入500ul試劑中,混勻后HCC-9906半自動生化儀上測定。
　　 8.統(tǒng)計方法
　　 各組數(shù)據(jù)應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差表示(X)±S表示,兩配對設計計量資料均數(shù)比較確定差值服從正態(tài)分布時,采用配對樣本t檢驗,差值不服從正態(tài)分布,采用Wilcoxon one-sample test。兩處理組重復測

21、量數(shù)據(jù)采用重復測量因素的方差分析(拒絕球形檢驗時,采用Greenhouse-Geisser法),P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.不同濃度鹽酸小檗堿對紅細胞形態(tài)的影響
　　 G6PD酶活性正常組:與生理鹽水組相比,加入不同濃度鹽水小檗堿后,紅細胞形態(tài)無改變,而蒸餾水組紅細胞雙凹圓盤狀結構減少,紅細胞腫脹、皺縮、變形紅細胞及紅細胞碎片增加；G6PD酶活性缺陷組:與生理鹽水組相比,0.1

22、mg/L、0.5mg/L濃度組紅細胞形態(tài)無明顯改變,隨濃度增加上述紅細胞形態(tài)改變更顯著,蒸餾水組較G6PD酶活性正常組紅細胞破壞現(xiàn)象更明顯。
　　 2.不同濃度鹽酸小檗堿對紅細胞計數(shù)的影響
　　 G6PD酶活性正常組:與生理鹽水組相比,各濃度鹽酸小檗堿對紅細胞計數(shù)影響無統(tǒng)計學意義(P值>0.05),蒸餾水組紅細胞計數(shù)明顯減少,差別有統(tǒng)計學意義(P值<0.05)；G6PD酶活性缺陷組:與生理鹽水組相比,0.1mg/L及0.

23、5mg/L組紅細胞計數(shù)的改變無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而1.0mg/L與5.0mg/L組紅細胞計數(shù)下降,其改變有統(tǒng)計學意義(P<0.05),蒸餾水組紅細胞計數(shù)明顯減少,差別有統(tǒng)計學意義(P值<0.05)。
　　 3.不同濃度鹽酸小檗堿對全血中血漿游離血紅蛋白水平的影響
　　 全血中加入鹽酸小檗堿溶液后,與生理鹽水組相比,發(fā)現(xiàn)無論G6PD酶活性正常組或G6PD酶活性下降組血漿游離血紅蛋白水平均下降(P<0.05),且隨

24、著藥物濃度的增大,血漿游離血紅蛋白水平呈進一步下降趨勢,而蒸餾水組血漿游離血紅蛋白均升高,且與生理鹽水組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4.全血和血漿中分別加入鹽酸小檗堿溶液后血漿游離血紅蛋白值比較:
　　 G6PD酶活性正常組全血和血漿中加藥后相比,血漿游離血紅蛋白值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但G6PD酶活性缺乏組全血中加Ber后血漿游離血紅蛋白值高于血漿中加Ber組,且1.0mg/L及5.0mg

25、/L組其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明全血中游離血紅蛋白含量增加,提示有紅細胞破壞現(xiàn)象。
　　 5.血漿中加入Ber后血漿游離血紅蛋白水平的動態(tài)變化:
　　 為了解Ber能使血漿游離血紅蛋白測定值降低的時效性,觀察在加藥后不同時間點血紅蛋白值變化。結果發(fā)現(xiàn)加藥后不久血漿游離血紅蛋白值既開始下降,至加藥后60分鐘降至最低點,后逐漸回升,至加藥后6小時幾乎回升至加藥前水平,之后未見明顯變化,提示鹽酸小檗堿使血漿中游離

26、血紅蛋白測定值下降的時效在6小時以內。
　　 6.加藥6小時后不同濃度鹽酸小檗堿對血漿游離血紅蛋白的影響:
　　 為了排除Ber能在6小時內使血漿游離血紅蛋白測定值降低的影響,于加藥后6小時檢測血漿游離血紅蛋白值。結果顯示:與生理鹽水相比,G6PD酶活性正常組隨鹽酸小檗堿濃度增大,血漿游離血紅蛋白值無明顯變化(P>0.05)；G6PD酶活性缺乏組隨鹽酸小檗堿濃度增大,血漿游離血紅蛋白值呈增高趨勢,且與生理鹽水組相比,1.

27、0mg/L組,5.0mg/L濃度組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其他組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 7.不同濃度鹽酸小檗堿對G6PD酶活性測定值的影響:
　　 G6PD酶活性正常組:與生理鹽水組相比,隨鹽酸小檗堿濃度增大,G6PD酶活性無明顯變化,蒸餾水組G6PD酶活性明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；G6PD酶活性缺乏組:隨鹽酸小檗堿濃度增大,G6PD酶活性呈增高趨勢,與生理鹽水組相比,1.

28、0mg/L,5.0mg/L濃度組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而蒸餾水組酶活性增高,與生理鹽水組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 總結：
　　 以G6PD酶缺陷患者紅細胞為研究對象,觀察中藥黃連的主要藥理成分——鹽酸小檗堿,在4個藥物濃度對患者紅細胞的影響,結論如下:
　　 1.血藥濃度小于等于0.5mg/L時,對G6PD酶缺乏者紅細胞無明顯影響；血藥濃度為1mg/L及5mg/L時對G6PD酶缺