葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)的泛素化調(diào)控介導(dǎo)糖尿病腎病足細(xì)胞的損傷.pdf

1、第一部分高糖通過(guò)増加G6PD的泛素化降解降低足細(xì)胞內(nèi)G6PD的表達(dá)
　　目的：觀察高糖高脂對(duì)足細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞骨架以及氧化還原的影響，過(guò)表達(dá)G6PD能否改善，以及研宄G6PD泛素化修飾的情況。
　　方法：檢測(cè)高糖高脂培養(yǎng)下足細(xì)胞體內(nèi)cleaved caspase-3的表達(dá)；檢測(cè)高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞體內(nèi)NADPH、GSH/GSSG、細(xì)胞內(nèi)R O S聚集情況；利用MTT方法檢測(cè)高糖培養(yǎng)對(duì)足細(xì)胞的增殖的影響；利用鬼筆環(huán)肽熒光染色的

2、方法檢測(cè)高脂培養(yǎng)下足細(xì)胞F-actin排列的情況；利用質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)構(gòu)建pCDNA3.0-Flag-G6PD質(zhì)粒。足細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆纸M，正常葡萄糖（N G，5.6mmol/L)、高濃度葡萄糖（H G，25mmol/L)、高濃度葡萄糖同時(shí)加過(guò)表達(dá)G6 P D腺病毒（HG/Ad2)及高濃度葡萄糖同時(shí)加空載腺病毒（HG/Laz); BSA對(duì)照、500pmol/L棕櫚酸、500pmol/L棕櫚酸加G6PD腺病毒、500^mol/L棕櫚酸加空載腺

3、病毒。HEK293T細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆纸M：His-Ub質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組;His-Ub和Flag-G6PD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組;His-Ub質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+MG132(20uM)組;His-Ub和Flag-G6PD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染+MG132(20uM)組。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后，R IP A裂解液裂解細(xì)胞，用Anti-Flag beads富集細(xì)胞裂解液中Flag-G6PD的蛋白，用H is的抗體進(jìn)行G6PD泛素化的檢測(cè)。Input樣品利用Westernblot方法

4、及抗體檢測(cè)相應(yīng)的蛋白。
　　結(jié)果：1、下糖下脂引起的足細(xì)胞的調(diào)亡，能夠被過(guò)表達(dá)的G6PD所改善。
　　2、高脂培養(yǎng)能夠使足細(xì)胞的F-actin骨架紊亂和氧化還原的失衡，G6 P D過(guò)表達(dá)則能夠逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。
　　3、通過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)，成功構(gòu)建pCDNA3.0-Flag-G6PD質(zhì)粒。
　　4、與其他組相比，His-Ub和 Flag-G6PD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染+MG132組能夠顯著增加G6PD的泛素化修飾。
　　結(jié)論

5、：過(guò)表達(dá)G6PD可以部分逆轉(zhuǎn)高糖高脂對(duì)足細(xì)胞增殖、凋亡、形態(tài)和氧化還原的影響以及高糖通過(guò)泛素蛋白酶體途徑降低足細(xì)胞內(nèi)G6PD的表達(dá)。
　　第二部分V H L參與G6PD泛素蛋白酶體途徑的降解
　　目的：查找并驗(yàn)證介導(dǎo)G6PD泛素化降解的E3酶。
　　方法：利用質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)，構(gòu)建質(zhì)粒pCDNA3.0-HA-VHL。利用酵母雙雜交技術(shù)成功的篩選參與G6 P D的泛素化的E3酶。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),HEK293T細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

6、分為2個(gè)組：H A-V H L質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、：Flag-G6PD和 H A-V H L質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組。兩組在轉(zhuǎn)染的最后6小時(shí)均加入MG132(20uM)，Co-IP裂解液裂解細(xì)胞，用Anti-Flag beads富集細(xì)胞裂解液中：Flag-G6PD的蛋白，用 H A的抗體檢測(cè)H A-V H L蛋白。體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)，HEK293T細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃?組：His-Ub質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；Flag-G6PD和His-Ub質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組；Flag-G6PD

7、、His-Ub和 HA-VHL質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組。在轉(zhuǎn)染的最后6小時(shí)均加入MG132(20uM)，R IP A裂解液裂解細(xì)胞，用 Anti-Flag beads富集細(xì)胞裂解液中Flag-G6PD的蛋白，用 H is的抗體進(jìn)行G6PD泛素化的檢測(cè)。Input樣品利用Westernblot方法及抗體檢測(cè)相應(yīng)的蛋白。
　　結(jié)果：1、利用質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)，成功構(gòu)建質(zhì)粒pCDNA3.0-HA-VHL。
　　2、利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選出與G6 P