G6PD在AngⅡ誘導的HUVEC氧化應激中的作用.pdf

1、目的:葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)，是哺乳動物中一個重要的看家酶;在磷酸戊糖途徑中為首個限速酶，廣泛分布于全身各組織細胞內(nèi)。G6PD是機體正常的新陳代謝和生長發(fā)育過程中必不可少的一種酶;對維持胞漿池的NADPH和細胞的氧化還原平衡是不可缺少的。G6PD基因突變會造成G6PD蛋白部分功能的缺失，可導致新生兒黃疸，藥物或感染介導的溶血危象，蠶豆病等。最近的研究顯示G6PD在細胞和生物體的生理機能等方面具有重要作用。G6PD活性缺失，會

2、干擾氧化還原的平衡狀態(tài)，可導致細胞生長失調(diào)和信號傳導異常，還會出現(xiàn)胚胎發(fā)育異常，增加退化性疾病的易感性等。但到目前為止，細胞處于氧化應激狀態(tài)時，G6PD的活性變化以及與磷酸戊糖途徑的關系尚不清楚，因此，研究G6PD的活性變化對了解如何維持細胞內(nèi)NADPH和細胞的氧化還原平衡狀態(tài)以及相關疾病的發(fā)病機制都具有十分重要的意義。
　　人類的G6PD基因是一個X連鎖遺傳基因，位于Xq28區(qū)域，包含有13個外顯子和12個內(nèi)含子，長約有21kb

3、。第一個外顯子沒有編碼序列，位于第2和3外顯子中間的內(nèi)含子長約9kb。
　　血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是由血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化生成的多肽（八肽）物質(zhì);是腎素—血管緊張素系統(tǒng)RAS中最為重要的活性物質(zhì)。RAS在維持機體血壓穩(wěn)定及調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)平衡中發(fā)揮了重要作用。RAS活性的變化與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展具有密切相關性。在動脈硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中，AngⅡ通過多種效應參與。AngⅡ刺激導致血管產(chǎn)生過量的自由基，進一步導致血管內(nèi)皮細胞損傷，

4、發(fā)生炎癥反應和功能障礙，成為動脈粥樣硬化的基礎。但是血管內(nèi)皮細胞在處于氧化應激狀態(tài)時，細胞內(nèi)會出現(xiàn)什么樣的變化？G6PD活性會有怎樣變化以及與磷酸戊糖途徑又有什么關系，尚不清楚。
　　基于上述情況，本實驗選用人臍靜脈內(nèi)皮細胞株（HUVEC）作為研究對象，使用AngⅡ刺激細胞復制氧化應激的模型，觀察細胞內(nèi)一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、NADP/NADPH及G6PD蛋白的變化。對AngⅡ致HUVEC的氧化應激時，G6PD的

5、變化以及與磷酸戊糖途徑的關系進行研究。
　　方法:
　　1.細胞培養(yǎng)
　　人臍靜脈內(nèi)皮細胞株用含有100μg/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10％ FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，置37℃，5％ CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24小時，換用無血清的DMEM培養(yǎng)基再培養(yǎng)24小時。然后換用含有刺激因素和10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至所需時間后，收集細胞或上清液用于以下實驗。
　　2.活性氧(ROS)的檢測
　　

6、(1)分別給予細胞0，10-6，10-7，10-8mmol/L AngⅡ刺激，作用相同的時間1h后，采用活性氧檢測試劑盒對不同濃度產(chǎn)生的活性氧進行檢測。
　　(2)用相同濃度10-6mmol/L的AngⅡ，分別給予細胞0h，0.5 h，1h，3h的刺激后，采用活性氧檢測試劑盒對不同時間產(chǎn)生的活性氧進行檢測。
　　3.NADP/NADPH的變化檢測
　　給予細胞相同濃度（10-6mmol/L）AngⅡ的刺激后，分別作用0

7、 min，5min，15min，30min，60min，90min，120min后收取細胞，按試劑盒說明書熔煉細胞2次，進行測定。
　　4.G6PD活性變化測定
　　給予細胞相同濃度（10-6mmol/L）AngⅡ的刺激后，分別作用0 min，5min，15min，30min，60min，90min，120min后收取細胞，裂解蛋白并定量，凍于-70℃。按試劑盒說明書進行測定。
　　5.G6PD蛋白表達變化檢測

8、　　給予細胞相同濃度（10-6mmol/L）AngⅡ的刺激后，分別作用0 min，5min，15min，30min，60min，90min，120min后收取細胞，提取蛋白，Western Blotting對G6PD進行測定。
　　6.NOS及NO的檢測
　　(1)分別給予細胞0 min，5min，15min，30min，60min，90min，120min用相同濃度10-6mmol/L的AngⅡ的刺激后，收取細胞上清液，采

9、用NO試劑盒進行檢測。
　　(2)分別給予細胞0 min，5min，15min，30min，60min，90min，120min用相同濃度10-6mmol/L的AngⅡ的刺激后，收取細胞上清液，采用NOS試劑盒進行檢測。
　　7.數(shù)據(jù)處理
　　所有數(shù)據(jù)均用(X)±S表示，采用SPSS16.0軟件進行處理，對所測定結(jié)果進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA)，以P＜0.05為

10、差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.AngⅡ刺激HUVEC后ROS的產(chǎn)生增多。
　　(1)不同濃度的AngⅡ(0，10-6，10-7，10-8mmol/L)刺激細胞1h后，熒光顯微鏡下觀察，以10-6mmol/L時熒光強度最強。
　　(2)用10-6mmol/L AngⅡ刺激細胞0h，0.5h，1h，3h，6h后，熒光顯微鏡下觀察，以1h時熒光強度最強。
　　2.HUVEC氧化應激發(fā)生發(fā)展過程中NADP

11、/NADPH(Ratio)逐步下降。
　　用10-6mmol/L AngⅡ分別給予細胞0 min，5min，15min，30min，60min，90min，120min刺激后:
　　隨著時間的延長，NADP/NADPH(Ratio)5min明顯增加后，逐步下降，于1時達到最低。
　　NADP/NADPH的變化提示在氧化應激發(fā)生、發(fā)展過程中，磷酸戊糖途徑的代謝活性短暫受到抑制后，逐步增強。
　　3.內(nèi)皮細胞氧化應激

12、的發(fā)生、發(fā)展過程中G6PD的活性及含量的變化。
　　HUVEC給予10-6mmol/L AngⅡ刺激后，分別于0 min，5min，15min，30min，60min，90min，120min檢測。結(jié)果表明，G6PD的活性隨時間的延長，呈現(xiàn)先下降后上升的變化規(guī)律，說明氧化應激初始期G6PD活性受到抑制，隨著時間的延長，其活性逐漸恢復。而G6PD蛋白表達的變化與G6PD活性的改變呈平行關系。
　　4.AngⅡ刺激HUVEC后可

13、使NO的含量、NOS的活性下降。
　　用相同濃度10-6mmol/L的AngⅡ分別給予細胞0 min，5min，15min，30min，60min，90min，120min刺激。
　　A細胞中NO表達水平在5min時升高，之后隨著時間的延長呈下降性趨勢，并于1時達到最低峰。
　　B細胞中NOS活性同樣在5min時出現(xiàn)升高，之后隨著時間的延長呈下降性趨勢。
　　細胞內(nèi)NO含量的降低及NOS活性的下降，說明內(nèi)皮細胞的