辣椒疫病生防菌Penicillium striatisporum Pst10的篩選、抗菌物質(zhì)分離純化及分子標(biāo)記.pdf

1、辣椒疫病是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的、世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的、毀滅性土傳病害，20世紀(jì)90年代曾在中國(guó)20多個(gè)省連續(xù)爆發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于疫霉菌特殊的生物學(xué)性狀及其所在的土壤生態(tài)環(huán)境的復(fù)雜性，該病害的化學(xué)防治一直較為困難。盡管有許多用生防微生物控制該病害發(fā)生的報(bào)道，但防效均不理想。 本研究從挖掘生防微生物資源、獲得天然抗菌化合物角度出發(fā)，開(kāi)展了從各種生境中進(jìn)行辣椒疫霉拮抗菌的篩選、盆栽

2、防效試驗(yàn)、拮抗物質(zhì)生成的最適培養(yǎng)條件確定、拮抗物質(zhì)的分離純化、鑒定及分子標(biāo)記研究，取得如下結(jié)果。 以辣椒疫霉為靶標(biāo)病原菌，從連作辣椒不同年限的土壤、用不同原料及制作工藝制得的堆肥、各種蔬菜作物體內(nèi)等各種生態(tài)環(huán)境中篩選到辣椒疫霉的拮抗菌205株，其中拮抗真菌32株，拮抗放線菌78株，拮抗細(xì)菌95株，其中內(nèi)生芽孢細(xì)菌37株，將在室內(nèi)平板上拮抗作用強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的放線菌A576、A329、芽孢細(xì)菌B105、BS211、真菌Tpc、Ps

3、t10進(jìn)行液體培養(yǎng)，通過(guò)各菌株無(wú)菌培養(yǎng)濾液(sterile liquid culturefilter，SLCF)對(duì)辣椒疫霉的抑菌活性及各菌株菌體及液體培養(yǎng)物對(duì)辣椒疫病的盆栽防效比較，顯示真菌Pst10有較好的辣椒疫病生防潛力。經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物菌種保藏中心鑒定，Pst10為青霉稀有種Penicillium striatisporum.首次報(bào)道在中國(guó)境內(nèi)分離到該種青霉，并將其應(yīng)用于植物病害的生物防治。 抗菌譜測(cè)定表明青霉Pst

4、10對(duì)p.capsici、p.infestans、p.drechsleri、p.nicotianae、p.megasperma五種疫霉菌的菌絲生長(zhǎng)均有強(qiáng)烈的抑制作用，拮抗帶寬度30mm，并且對(duì)Cladosporium cucumerium和Sclerotinia sclerotiorum也有較強(qiáng)的拮抗作用，且在室內(nèi)平板上，拮抗帶30天不消失。Pst10液體培養(yǎng)制備的SLCF能殺死辣椒疫霉菌絲細(xì)胞，抑制孢子囊的形成，抑制孢子囊及孢子的萌發(fā)

5、，SLCF稀釋10-100倍仍能使辣椒疫霉菌絲呈現(xiàn)直徑明顯增粗、菌絲前端扭曲、菌絲分枝增加、分枝菌絲節(jié)間縮短等畸形癥狀。在辣椒基質(zhì)盆栽實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)施用Pst10的SLCF，在6天內(nèi)能完全抑制疫病的發(fā)生，13天后，防效仍保持45％。在菜園土盆栽實(shí)驗(yàn)中，有機(jī)肥能明顯促進(jìn)Pst10在辣椒根際的定殖：盆缽栽苗10d后，青霉Pst10+有機(jī)肥處理中，辣椒根際青霉Pst10的數(shù)量是單獨(dú)施加青霉Pst10處理的3倍；20d后上升為17倍。接種后40d

6、，青霉Pst10在根際的數(shù)量仍有2.55×104cfu/g干土，占根際真菌總數(shù)的53％，有很強(qiáng)的定殖及保持優(yōu)勢(shì)種群的能力.青霉Pst10不同處理的防病實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：SLCF+Pst10+有機(jī)肥的處理對(duì)辣椒疫病的防效最好，移栽后14天，疫病發(fā)病率也僅有10％，對(duì)照發(fā)病率為100％。 Pst10在5種固體培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度、分泌物及孢子產(chǎn)生數(shù)量等生物學(xué)形狀有很大差別，OAT是最適宜的產(chǎn)孢培養(yǎng)基。Pst10在9種液體培養(yǎng)基中的生

7、物量、菌絲球形狀及SLCF的抗菌活性也有顯著性差異。綜合考慮菌絲生物量和SLCF的抗菌活性，PEDB是Pst10最適宜的液體培養(yǎng)基。在9種培養(yǎng)基中都能生長(zhǎng)，在Vogel及Jackson培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好但卻沒(méi)有抗菌物質(zhì)生成，可見(jiàn)菌絲生長(zhǎng)和抗菌物質(zhì)生成之間沒(méi)有必然相關(guān)性?？咕镔|(zhì)生成的培養(yǎng)條件研究表明，接種量對(duì)抗菌物質(zhì)生成沒(méi)有影響，Pst10在20-37℃溫度范圍內(nèi)都能代謝產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，但28℃是最適合的溫度。裝液量對(duì)抗菌物質(zhì)的生成有影響，

8、250 mL三角瓶中裝20-100 mL液體培養(yǎng)基對(duì)青霉Pst10代謝產(chǎn)生抗菌物質(zhì)沒(méi)有明顯差異，裝液超過(guò)100mL，抗菌物質(zhì)的生成減少，說(shuō)明Pst10產(chǎn)生抗菌物質(zhì)需要氧氣。在最適培養(yǎng)條件下，Pst10從第4天開(kāi)始大量產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，第8天達(dá)到高峰，高峰期維持7-8天. 對(duì)SLCF的抗菌活性檢測(cè)方法開(kāi)展了研究。在SLCF制備中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種量為1-4個(gè)菌餅時(shí)，用細(xì)菌濾膜過(guò)濾制備SLCF的抗菌活性顯著低于用高速離心法獲得SLCF的活性，

9、部分抗菌物質(zhì)被吸附在濾膜上，但這種差異隨著接種量的增加而減小。推測(cè)可能接種量對(duì)Pst10的SLCF的總體活性沒(méi)有明顯影響，但對(duì)Pst10產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的種類(lèi)有影響：接種量小時(shí)，Pst10產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)中，易被細(xì)菌濾膜吸附的抗菌物質(zhì)占較大比例；接種量大時(shí)，Pst10產(chǎn)生較多不被濾膜吸附的抗菌物質(zhì)。由此可見(jiàn)Pst10代謝產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)是復(fù)雜多樣的。采用平板打孔-抑菌圈法、含毒平板-菌絲生長(zhǎng)抑制法及SLCF直接滴加三種方法對(duì)SLCF的抗菌活性

10、進(jìn)行檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)SLCF直接滴加法最靈敏；研究還發(fā)現(xiàn)，活性檢測(cè)所用的培養(yǎng)基種類(lèi)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有明顯影響，SLCF在PDA上的抗菌活性大于在V8培養(yǎng)基上的活性。 與平板法檢測(cè)抗菌物質(zhì)相比，薄層層析法(TLC)檢測(cè)能獲取更多信息，因?yàn)樵跈z測(cè)的同時(shí)就對(duì)抗菌物質(zhì)進(jìn)行了初步的分離。通過(guò)觀察薄層層析板上抑菌圈的數(shù)量及位置就可初步判斷抗菌物質(zhì)的大概有幾大類(lèi)及各類(lèi)抗菌物質(zhì)的相對(duì)極性強(qiáng)弱。 將Pst10的PEDB培養(yǎng)液經(jīng)紗布過(guò)濾，把濾液離心

11、、真空濃縮100倍后用乙酸乙酯萃取獲得抗菌物質(zhì)粗提物；該粗提物經(jīng)TLC分離后，在254nm紫外光線下觀察到6條帶，分別將6條帶中的化合物回收后用辣椒疫霉進(jìn)行生物測(cè)定，結(jié)果顯示只有條帶5有抗菌活性；將從條帶5中回收的抗菌物質(zhì)經(jīng)硅膠柱層析，洗脫液中第5-8管有抗菌活性，將4管洗脫液合并濃縮后經(jīng)HPLC分離，初步共收集到4組有活性的組分，改變洗脫條件，凸顯有活性的洗脫峰，用HPLC制備型分離柱收集獲得2個(gè)含量最大的活性組分fraction1和

12、fraction5；將組分1和組分5進(jìn)行1HNMR和13CNMR及二維NMR分析、紫外吸收光譜掃描，最后鑒定為Calbistrin A和Calbistrin B，二者互為同分異構(gòu)體，分子式C31H40O8，分子量540.26。在中間每個(gè)分離步驟所得的活性物質(zhì)中都能檢測(cè)到Calbistrin A和Calbistrin B存在，說(shuō)明二者均是由Pst10代謝產(chǎn)生。 對(duì)常見(jiàn)微生物的生物活性測(cè)定顯示：Calbistrin A和Calbis

13、trin B對(duì)假單胞菌細(xì)菌沒(méi)有活性，但對(duì)芽孢細(xì)菌有抗生活性，且Calbistrin B的活性顯著高于Calbistrin A。Calbistrin A和Calbistrin B對(duì)辣椒疫霉孢子萌發(fā)的MIC分別為7.5μg/mL和1.25μg/mL，Calbistrin B的活性是Calbistrin A的6倍。種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)顯示，Calbistrin B的濃度對(duì)蘿卜種子的發(fā)芽率及根長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。 采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得Pst