豫西地區(qū)兔巴氏桿菌病病原特性與PCR檢測技術研究.pdf

1、兔巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起兔的一種傳染病，該病傳播快、病程急、發(fā)病率與死亡率高，常給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大損失。該病病原血清型復雜，不同血清型之間交互免疫效果不理想，且在不同地區(qū)流行的血清型差異較大，給防治工作帶來較大難度。為了摸清豫西地區(qū)兔巴氏桿菌病的具體發(fā)生情況，并對該病做到早期快速診斷與有效預防，本研究主要從以下4方面進行了研究： 1.兔多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定 本研究對2003～2005年間來自豫西地區(qū)的疑似巴

2、氏桿菌病兔進行剖檢與病原分離，先后共鑒定多殺性巴氏桿菌18株，分別編號為P1、P2……P18，其中P1、P2……P11來源于肉免，P12. P13……P18來源于獺兔。血清瓊脂平板上，18株分離菌的菌落所帶的熒光有三類，F(xiàn)o型熒光10株，F(xiàn)g型熒光5株，中間型3株。藥敏試驗表明，18株分離菌一半以上對氟哌酸、慶大霉素、痢特靈3種常用抗菌藥耐藥；對強力霉素、環(huán)丙殺星的耐藥菌株較少；多數(shù)菌株對先鋒霉素、紅霉素、卡那霉素、四環(huán)素、青霉素、氨芐

3、青霉素中度敏感或高度敏感。毒力試驗結(jié)果表明，18株分離菌中有10株(P1、P2、P5、P6、P8、P10、P11、P13、P15、P16)對仔兔的致死菌量在20 cfu/只以下，毒力比較強，占分離株的55.6％。其中5株(P1、P2、P8、P13、P16)分離菌的致死菌量在10 cfu/只以下，為強毒。不同熒光型的菌株毒力不同，F(xiàn)o型菌、Fg型菌對小白鼠與仔兔的毒力比較強，中間型菌毒力較弱。 2.兔多殺性巴氏桿菌分離株免疫學特性

4、研究 本研究在病原分離鑒定的基礎上，對18株巴氏桿菌分離株進行了血清學分型鑒定。采用間接血凝試驗對分離株的莢膜抗原進行鑒定，結(jié)果表明18株分離菌的莢膜抗原均為A群；采用瓊脂擴散試驗對18株分離菌的菌體耐熱抗原進行鑒定，結(jié)果表明分離株的菌體耐熱抗原主要有兩型：1型14株(77.8％)、3型4株(22.2％)。將P1、P2、P5、P6、P8、P10、P11、P13、P15、P16毒力較強的10株巴氏桿菌分離株接種改良馬丁肉湯進行培養(yǎng)

5、，菌液用甲醛滅活制成滅活疫苗；將疫苗接種小白鼠進行免疫保護試驗，疫苗接種后21天，分別用同源菌株、標準株C51-2、標準株C51-3攻擊，其保護數(shù)在3/5以上的分別有9株、7株、4株。用這10株滅活疫苗對哈白兔接種進行免疫保護試驗，疫苗接種后14天，用同源菌株攻擊，保護數(shù)在3/5以上有7株；用標準株C51-2攻擊，保護數(shù)在3/5以上的4株；用標準株C51-3攻擊，保護數(shù)在3/5以上的3株。選用免疫保護效果較好的兩個血清型巴氏桿菌分離株P

6、1(A:1)、P2(A:3)滅活疫苗接種家兔，用兔巴氏桿菌標準株C51-2(A:1)、C51-3(A:3)分別攻毒進行交互免疫試驗，結(jié)果表明1型菌P1株滅活疫苗對3型菌有一定的交互免疫作用，3型菌P2株滅活疫苗對1型菌的交互免疫作用較弱。 3.兔多殺性巴氏桿菌二價蜂膠滅活疫苗的研制 為有效控制豫西地區(qū)兔巴氏桿菌病的發(fā)生，保障養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展，本研究選用免疫保護效果較好的多殺性巴氏桿菌地方分離強毒株P1(A:1)、P2(A

7、:3)為疫苗株，以改良馬丁肉湯進行液體培養(yǎng)制備抗原，將滅活的抗原輔以具有廣譜生物學活性的天然物質(zhì)-蜂膠為免疫增強劑，制備了兔巴氏桿菌二價蜂膠滅活疫苗。動物免疫試驗結(jié)果表明，二價蜂膠滅活疫苗安全可靠，免疫后14d可產(chǎn)生堅強保護力，對兔巴氏桿菌病的近期保護率明顯優(yōu)于二價水苗，可高達100％。以實驗動物小白鼠代替本動物進行二價疫苗效力檢驗取得成功，本效力檢驗方法可降低檢驗成本，具有更敏感、更特異、更客觀、更簡便等特點。用瓊脂擴散試驗測定動物接

8、種疫苗后的抗體消長規(guī)律，用攻毒法測定疫苗的免疫期與保存期。結(jié)果表明，該疫苗的免疫期為6個月以上；4℃～8℃的保存期為12個月，15℃～30℃的保存期為6個月。 4.兔多殺性巴氏桿菌PCR檢測方法的建立及應用 傳統(tǒng)的兔巴氏桿菌病實驗室診斷常采用涂片染色鏡檢、病原分離、生化鑒定等方法，但這些方法較繁雜費時，且檢出率較低。為建立本病快速特異的檢測方法，本研究根據(jù)Genbank中13株多殺性巴氏桿菌的外膜蛋白(OmpH)基因序列

9、，在其高度保守區(qū)設計了一對特異性引物，建立了兔多殺性巴氏桿菌的PCR檢測方法，并對DNA的提取方法進行了比較，對PCR體系各反應條件進行了優(yōu)化。本實驗建立的兔多殺性巴氏桿菌的PCR擴增片段大小為526bp。兔和禽類的標準株C51-2和C48-1均能擴增出526bp的特異性目的條帶，對實驗室分離的18株兔巴氏桿菌也均能擴增出526bp的目的條帶。而對兔大腸桿菌、鏈球菌、支氣管敗血性波氏桿菌和葡萄球菌球菌的擴增結(jié)果均為陰性。敏感性檢測結(jié)果表

10、明，當反應體系中模板DNA的量為1pg時，仍能看到較清晰的條帶，說明建立的PCR方法敏感性較好，只要檢測樣品中有病原核酸存在，PCR反應即可順利完成，而得到準確診斷結(jié)果。用該PCR法檢測了先后從洛陽、三門峽等周邊地區(qū)送檢的40份疑似巴氏桿菌病兔病料，檢出多殺性巴氏桿菌陽性29例，陽性率為72.5％。同時與傳統(tǒng)的細菌檢查法進行了比較。結(jié)果顯示，該PCR檢測法的檢出率是傳統(tǒng)的實驗室細菌檢查法的2.08倍，說明該PCR方法在臨床診斷中具有極強