CpG ODN107增強人腦膠質瘤U87細胞放射敏感性的體內(nèi)外生物學活性及機制研究.pdf

1、目的:
　　腦膠質瘤(gliomas)是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤,具有發(fā)病率、復發(fā)率、死亡率高和治愈率低的特點。由于腦膠質瘤呈浸潤性生長,手術治療無法將其完全切除,手術后聯(lián)合放射治療是目前腦膠質瘤的首選治療方法。但腦膠質瘤對射線不敏感或放射治療一段時間后對射線敏感性降低,放射增敏劑可提高射線對腫瘤細胞的殺傷作用,增強放療療效。因此,研制高效的放射增敏劑并闡明其作用機制、靶點,對提高腦膠質瘤的治愈率具有重要意義。
　　NO是

2、最有效的腫瘤放射增敏分子。在缺氧條件下,NO能提高瘤細胞對射線的敏感性,但其對人體具有明顯的神經(jīng)毒性作用。目前認為放射增敏劑主要的作用機制為:促進腫瘤細胞調亡、引起細胞周期阻滯于對射線敏感的G2或G1期、引起細胞自噬性死亡、影響信號傳導通路等。
　　CpGODN(CpG oligodeoxynucleotides)是含有未甲基化CpG基序的寡核苷酸片段,是細菌DNA產(chǎn)生免疫刺激作用的最小單位。近年來,CpGODN作為新的放射增敏劑

3、備受關注。實驗結果認為CpGODN的放射增敏作用與活化NK細胞、誘導腫瘤細胞分泌NO、TNF-α有關。
　　本實驗是國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項“放射增敏劑候選藥物CpGODN107的研究”(2009ZX09103-051)的研究內(nèi)容之一。以自主研發(fā)的CpGODN107為研究對象,探討CpGODN107對人腦膠質瘤U87細胞的放射增敏作用并闡明其闡明其作用機制,為尋找高效、低毒的放射增敏藥物奠定實驗基礎,同時也為腦膠質瘤治療提

4、供新的思路。
　　研究內(nèi)容及方法:
　　一、CpG ODN107增強U87細胞放射敏感性的體內(nèi)外生物學活性研究
　　1.體外放射增敏作用研究
　　(1)MTT法測定不同劑量的β射線(0、2、4、6、8、10Gy)對U87細胞活力的影響;不同濃度的CpGODN107(1、3、10、30、90μg/mL)對U87細胞活力的影響;CpGODN107聯(lián)合射線對U87細胞活力的影響。
　　(2)集落形成法評價CpGO

5、DN107聯(lián)合射線對U87細胞增值能力的影響。
　　2.體內(nèi)放射增敏作用研究
　　(1)建立人腦膠質瘤U87細胞皮下移植瘤裸鼠模型,評價CpGODN107聯(lián)合射線對移植瘤的生長抑制及腫瘤生長延遲時間的影響。
　　(2)建立人腦膠質瘤U87細胞原位移植瘤裸鼠模型,評價CpGODN107聯(lián)合射線對裸鼠生存期的影響。
　　二、CpGODN107聯(lián)合射線對U87細胞增殖與死亡的影響。
　　1.流式細胞術觀察CpGO

6、DN107聯(lián)合射線對U87細胞周期的影響。
　　2.流式細胞術觀察CpGODN107聯(lián)合射線對U87細胞凋亡的影響。
　　3.CpGODN107聯(lián)合射線對U87細胞自噬的影響。
　　(1)透射電鏡法觀察CpGODN107聯(lián)合射線對自噬體形成的影響。
　　(2)Westernblot檢測CpGODN107聯(lián)合射線對自噬標志蛋白LC3和beclin-1表達的影響。
　　(3)免疫熒光觀察CpGODN107聯(lián)合射

7、線對U87/GFP-LC3細胞綠色熒光聚集的影響。
　　三、CpGODN107對細胞信號轉導通路的影響。
　　1.CpGODN107對TLR9/NF-κB信號轉導通路的影響。
　　(1)Griess法檢測U87細胞NO生成。
　　(2)ELISA法檢測U87細胞iNOS蛋白表達。
　　(3)Realtime-PCR檢測TLR9mRNA表達。
　　(4)ELISA法檢測U87細胞NF-κB活化。

8、　　2.CpGODN107對HIF-1α/VEGF信號轉導通路的影響。
　　(1)免疫組化法檢測腦膠質瘤組織CD34蛋白表達,通過測量內(nèi)皮細胞表面抗原CD34來計量微血管密度。
　　(2)ELISA法檢測U87細胞VEGF蛋白表達、腦膠質瘤組織VEGF蛋白表達。
　　(3)Western blot法檢測U87細胞HIF-1α蛋白表達、免疫組化法檢測腦膠質瘤組織中HIF-1α蛋白表達。
　　研究結果:
　　一

9、、CpGODN107對人腦膠質瘤U87細胞具有放射增敏作用研究。
　　1.10μg/mLCpGODN107能顯著提高U87細胞對β射線敏感性。
　　2.10μg/mLCpGODN107聯(lián)合射線(5Gy,7MeV)能顯著抑制U87細胞活力及增殖能力。
　　3.1.7、5、15mg/kgCpGODN107分別聯(lián)合單次大劑量射線(10Gy)對U87細胞裸鼠皮下移植瘤生長具有明顯的抑制作用,其抑制率分別為27.3％、67.0%

10、和65.5%;同時能夠顯著延長其TGD和TVQT。
　　4.0.75,0.25and0.083mg/kgCpGODN107分別聯(lián)合大劑量射線(10Gy)能延長原位移植瘤模型裸鼠的中位生存時間(23d、28d、37.5d)。其中,0.083mg/kg的CpGODN107聯(lián)合單次大劑量射線(10Gy)能顯著延長原位移植瘤裸鼠的生存期。
　　二、CpGODN107對人腦膠質瘤U87細胞周期、凋亡、自噬的影響。
　　1.CpG

11、ODN107聯(lián)合射線可使U87細胞周期阻滯于G1期。
　　2.CpGODN107聯(lián)合射線不能促進U87細胞凋亡。
　　3.CpGODN107聯(lián)合射線可誘導U87細胞自噬。
　　(1)CpGODN107聯(lián)合射線可誘導U87細胞自噬體形成。
　　(2)CpGODN107聯(lián)合射線可上調自噬標志蛋白LC3和beclin-1的表達。
　　(3)CpGODN107聯(lián)合射線可誘導U87/GFP-LC3細胞綠色熒光聚集。<

12、br>　　三、CpGODN107對細胞信號轉導通路的影響。
　　1.CpGODN107對TLR9/NF-κB信號轉導通路的影響。
　　(1)CpGODN107聯(lián)合射線可促使U87細胞NO生成。
　　(2)CpGODN107聯(lián)合射線可上調U87細胞iNOS蛋白的表達。
　　(3)CpGODN107聯(lián)合射線可上調U87細胞TLR9mRNA表達。
　　(4)CpGODN107聯(lián)合射線可誘導U87細胞NF-κB活化

13、。
　　2.CpGODN107對HIF-1α/VEGF信號轉導通路的影響。
　　(1)CpGODN107聯(lián)合射線可下調腦膠質瘤組織CD34蛋白表達,降低腦膠質瘤組織微血管密度。
　　(2)CpGODN107聯(lián)合射線可下調U87細胞VEGF蛋白表達、下調腦膠質瘤組織中VEGF蛋白表達。
　　(3)CpGODN107聯(lián)合射線可下調U87細胞HIF-1α蛋白表達、下調腦膠質瘤組織中HIF-1α蛋白表達。
　　研究

14、結論:
　　1.CpGODN107能增強人腦膠質瘤U87細胞對射線的敏感性。
　　體外實驗結果表明,10μg/mLCpGODN107聯(lián)合射線能明顯降低腦膠質瘤U87細胞活力及細胞增殖能力;
　　體內(nèi)實驗結果表明,5mg/kgCpGODN107聯(lián)合射線對U87細胞裸鼠皮下移植瘤生長具有明顯的抑制作用,其抑制率高達67.0%;0.083mg/kg的CpGODN107聯(lián)合單次大劑量射線能顯著延長原位移植瘤裸鼠的生存期。

15、>　　2.CpGODN107聯(lián)合射線可誘導U87細胞阻滯于對射線較敏感的G1期,不能誘導細胞凋亡,但能誘導U87細胞自噬。提示,CpGODN107發(fā)揮放射增敏作用與其誘導U87細胞G1期阻滯和誘導細胞自噬性死亡密切相關。
　　3.CpGODN107可顯著增加人腦膠質瘤對射線的敏感性。其作用機制可能為TLR9/NF-κB途徑介導U87細胞釋放放射增敏分子NO;也可能是阻斷HIF-1α/VEGF信號通路抑制腫瘤組織周圍新生血管的形成。