Nothch1信號通路在人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖和凋亡中的作用及機制探討.pdf

1、研究背景和目的：
　　 膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)發(fā)病率、病死率最高的一種原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有侵襲性生長的特性，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，且多為致命性。雖然目前臨床上采取手術(shù)、放療、化療、免疫等手段進行綜合處理，膠質(zhì)瘤的診治已經(jīng)取得了很大的進步，但是腦膠質(zhì)瘤的總體治療效果仍然非常差，其發(fā)病機制尚不明確，也缺乏特異性治療藥物。新近的研究表明針對某些細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子靶點靶向治療藥物的研制是提高惡性腫瘤整體療效的重要手段之一。Notch信號通路在

2、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長、增殖、凋亡等過程起到?jīng)Q定作用，該途徑的異常激活與包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是機體為維持內(nèi)環(huán)境的平衡進行的主動性細(xì)胞死亡過程，受一系列凋亡相關(guān)基因的調(diào)控。在此過程中Notch信號及其下游效應(yīng)物發(fā)揮了重要作用，然而目前Notch信號途徑的精確調(diào)控作用并未闡明，特別是Notch信號異常激活對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，以及Notch信號異常活化后對下

3、游靶基因及凋亡過程的作用并不明確。本實驗通過體外培養(yǎng)人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞株，并分別加入Notch信號激活劑rhNF-κB和抑制劑DAPT，觀察rhNF-κB和DAPT對U87細(xì)胞增殖和凋亡過程的影響，初步探討Notch信號系統(tǒng)在人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系增殖與凋亡過程中的調(diào)控作用及其可能機制，為分子水平治療人腦膠質(zhì)瘤、抗腫瘤藥物的開發(fā)提供實驗和理論依據(jù)。
　　 研究內(nèi)容和方法：
　　 1、人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U-8

4、7 MG細(xì)胞株的培養(yǎng)：
　　 U87細(xì)胞在含10％FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代，置于37℃、5％CO2潮濕的恒溫箱中生長，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。將細(xì)胞分成3組，分別為rhNF-κB組、DAPT組以及空白對照組，培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞進行檢測。
　　 2、Notch信號對U87細(xì)胞增殖和凋亡過程的影響
　　 臺盼藍(lán)染色法和MTT法測定rhNF-κBT和DAPT作用于U87細(xì)胞后對細(xì)胞增殖活性的影響，倒置相差顯微

5、鏡下觀察U87細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。
　　 3、Notch信號調(diào)控U87細(xì)胞增殖凋亡的機制
　　 RT-PCR檢測各組U87細(xì)胞Notch1、Hes1、Bcl-2基因的表達(dá)，免疫熒光染色技術(shù)、Western Blot分別檢測各組蛋白的表達(dá)，測量各自的總灰度值，定量比較分析各組蛋白相對灰度值。
　　 4、統(tǒng)計學(xué)處理
　　 所有數(shù)據(jù)均采用mean±SD表示，應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0

6、進行單因素方差分析，采用卡方檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理，P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功培養(yǎng)了人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U-87 MG細(xì)胞，RT-PCR法檢測結(jié)果表明Notch1及Notch信號通路下游的靶基因Hes1在U87細(xì)胞株中均有表達(dá)，提示Notch1/Hes1信號通路在U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在。
　　 2、Notch信號對U87細(xì)胞增殖和凋亡過程的影響
　　 MTT檢測結(jié)果表明，培養(yǎng)

7、24、48、72、96 h后，rhNF-κB組細(xì)胞A值分別為0.185±0.007、0.398±0.012、0.735±0.015、1.083±0.031，DAPT組分別為0.102±0.003、0.130±0.004、0.161±0.006、0.194±0.003，對照組分別為0.167±0.005、0.265±0.008、0.496±0.011、0.737±0.016，與對照組相比，rhNF-κB組細(xì)胞有較高的活力，DAPT組和對照

8、組的細(xì)胞活力較差，發(fā)生了不同程度的凋亡(P<0.05)。通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，rhNF-κB組、DAPT組與對照組細(xì)胞的總凋亡率分別為0.96％±0.17％、26.51％±3.74％、8.76％±1.4％，與對照組相比，DAPT組細(xì)胞凋亡明顯，而rhNF-κB組細(xì)胞凋亡較少，差異有顯著性意義(P<0.05)。
　　 3、Notch信號調(diào)控U87細(xì)胞增殖凋亡的機制
　　 RT-PCR、免疫熒光、Western-blot檢

9、測rhNF-κB組、DAPT組與對照組細(xì)胞Notch1、Hes1、Bcl-2均有表達(dá)，其中Notch1 mRNA及其蛋白表達(dá)量分別為0.974±0.110和0.910±0.082、0.263±0.054和0.302±0.09、0.642±0.072和0.578±0.101，Hes1 mRNA及其蛋白表達(dá)量分別為0.833±0.106和0.896±0.145、0.241±0.047和0.423±0.090、0.402±0.088和0.69

10、6±0.115，Bcl-2 mRNA及其蛋白表達(dá)量分別為0.230±0.075和0.726±0.113、0.098±0.024和0.252±0.064、0.151±0.052和0.503±0.092。與對照組相比，rhNF-κB誘導(dǎo)組細(xì)胞各組基因表達(dá)量增加，DAPT組表達(dá)較少。通過Western Blot檢測，rhNF-κB誘導(dǎo)以后，Notch下游靶基因Hes1和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯增多，DAPT組表達(dá)明顯減少(P均<0.05)

11、，說明rhNF-κB能促使U87細(xì)胞逃避凋亡，DAPT則作用相反，促進細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 1、Notch1信號途徑在人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中存在，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、存活過程中發(fā)揮重要作用，rhNF-κB誘導(dǎo)后激活Notch信號，DAPT誘導(dǎo)后抑制。
　　 2、Notch1信號在人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株增殖凋亡過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，rhNF-κB誘導(dǎo)后激活Notch信號，促進U87細(xì)胞增殖，逃避凋亡；