DCX和SPARC共表達(dá)影響腦膠質(zhì)瘤U-87MG細(xì)胞放射敏感性及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：本課題主要通過(guò)構(gòu)建雙啟動(dòng)子介導(dǎo)的DCX和SPARC雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體（Ad-DCX-SPARC）并轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U-87MG細(xì)胞，探討DCX和SPARC雙基因?qū)τ赨-87MG細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲及放射敏感性的影響及其可能的作用機(jī)制，為膠質(zhì)瘤基因治療及其聯(lián)合放療提供理論依據(jù)。
　　方法：構(gòu)建Ad-DCX-SPARC重組腺病毒載體；用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)GFP的細(xì)胞比例確定重組腺病

2、毒對(duì)U-87MG細(xì)胞的最佳感染劑量；RT-PCR和Western blot法檢測(cè)DCX和SPARC在U-87MG細(xì)胞mRNA和蛋白水平的表達(dá)；采用MTT法檢測(cè)DCX和SPARC共表達(dá)（DCX-SPARC）及聯(lián)合 X線(xiàn)對(duì)膠質(zhì)瘤U-87MG細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；Transwell實(shí)驗(yàn)觀(guān)察DCX-SPARC對(duì)U-87MG細(xì)胞侵襲能力的影響；采用克隆形成法計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染Ad-DCX-SPARC及聯(lián)合X線(xiàn)照射的U-87MG細(xì)胞克隆形成率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCX

3、-SPARC對(duì)X線(xiàn)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分布的影響；Western blot法分析凋亡相關(guān)蛋白Bad、Bax、Bcl-2和侵襲相關(guān)蛋白MMP-2及MMP-9表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：激光共聚焦和流式細(xì)胞儀測(cè)定50MOI可作為腺病毒感染U-87MG細(xì)胞的最佳感染劑量；RT-PCR及 Western blot法分析腺病毒介導(dǎo)的外源性目的基因DCX和 SPARC在 U-87MG細(xì)胞中能夠成功轉(zhuǎn)錄及翻譯；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ad-DCX-S

4、PARC組的細(xì)胞存活率較Ad-GFP對(duì)照組降低，聯(lián)合X線(xiàn)照射后降低更為明顯；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果為Ad-DCX-SPARC組D0、Dq、SF2值均小于對(duì)照組；轉(zhuǎn)染Ad-DCX-SPARC對(duì)U-87MG細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯影響，但使8Gy照射后細(xì)胞凋亡率明顯增加；DCX-SPARC使處于G2期的細(xì)胞增多，但減少放射引起的G2期阻滯；Transwell結(jié)果顯示，Ad-DCX-SPARC組穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)少于A(yíng)d-GFP組；轉(zhuǎn)染Ad-DCX-SPARC

5、后細(xì)胞Bad、Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)均未發(fā)生明顯變化，8Gy照射后細(xì)胞的Bad、Bax蛋白水平較Ad-GFP組升高，而B(niǎo)cl-2蛋白則降低；Ad-DCX-SPARC組MMP-2、MMP-9蛋白水平較Ad-GFP組降低。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了雙啟動(dòng)子介導(dǎo)的DCX和SPARC雙基因共表達(dá)的腺病毒載體Ad-DCX-SPARC，并且能高效的轉(zhuǎn)染U-87MG細(xì)胞，最佳感染劑量為50MOI。DCX-SPARC能明顯抑制U-87MG細(xì)胞生