RNA干擾下調(diào)CIB1表達對膠質(zhì)母細胞瘤U87細胞生物學特性的影響.pdf

1、目的:1.構(gòu)建靶向鈣整合素結(jié)合蛋白1(calcium-and integrin-binding protein,CIB1)的慢病毒表達載體pGV-siCIB1。2.研究RNA干擾下調(diào)CIB1表達對膠質(zhì)母細胞瘤U87細胞的生長、凋亡、遷移的作用,并探討其可能的作用機制。
　　方法:1.針對CIB1基因序列(NM_006384),利用RNA干擾序列的設計原則,設計針對CIB1的RNAi序列,合成單鏈DNAoligio,退火配對產(chǎn)生雙鏈

2、,通過其兩端所含的酶切位點直接連入酶切后的RNAi慢病毒載體上;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細菌感受態(tài)細胞,PCR鑒定陽性重組子后,測序驗證,測序結(jié)果經(jīng)比對確認正確的克隆即為構(gòu)建成功的CIB1基因RNA干擾慢病毒表達載體pGV-siCIB1。2.將慢病毒表達載體感染293T細胞,進行病毒的包裝、純化、濃縮及病毒滴度的測定。以EGFP為報告基因,分別以MOI值1,5,10,100感染細胞,觀察感染后48h、72h、96h的感染效率,確定最佳感染

3、時間以及MOI值。3.采用MTT法檢測RNAi后CIB1對U87細胞生長的影響;流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡;劃痕試驗分別在0h、12h、24h、36h、48h觀察RNAi后CIB1對U87細胞遷移的作用。qRT-PCR法檢測細胞凋亡相關基因MRNA的表達。
　　結(jié)果:1.經(jīng)測序驗證,成功構(gòu)建慢病毒表達載體pGV-siCIB1。成功包裝病毒,純化、濃縮及測定病毒的滴度。2.pGV-siCIB1感染U87具有較高的感染效率,當MOI

4、=5時,感染效率達90％以上。3.MTT法證實RNAi后CIB1對人腦膠質(zhì)瘤細胞U87的生長抑制效應具有時間依賴的關系,隨時間延長,抑制作用逐漸增強,24-96h pGV-siCIB1感染組與NC感染組有統(tǒng)計學意義(P<0.05);流式細胞術(shù)顯示,RNAi后CIB1誘導了U87細胞的凋亡,NC感染組、pGV-siCIB1感染組凋亡率分別為0.22%、18.2%;細胞劃痕結(jié)果顯示,NC感染組及pGV-siCIB1感染組在0h、12h、24

5、h、36h、48h的細胞遷移距離差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而36h、48h NC感染組與pGV-siCIB1感染組的細胞遷移距離有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。qRT-PCR檢測細胞凋亡相關基因,結(jié)果表明pGV-siCIB1感染組與NC感染組相比Bcl-2mRNA的表達顯著降低,而Bax、P53、P21、Caspase3mRNA的表達顯著增高。二組凋亡相關基因的mRNA表達量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:1.