USP22對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生物學(xué)特性的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、研究背景
　　 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)起源于星形細(xì)胞或星形膠質(zhì)祖細(xì)胞，是成人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，在WHO顱內(nèi)腫瘤分類中屬星形細(xì)胞腫瘤Ⅳ級(jí)。因其具有高增殖和侵襲性行為，病情進(jìn)展迅速，預(yù)后差。結(jié)合藥物化療和放射治療的手術(shù)治療是經(jīng)典的治療方法，然而化療的毒性反應(yīng)、耐藥問題以及放療副反應(yīng)大，均導(dǎo)致目前多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療手段上尚無突破性進(jìn)展。
　　 在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生過程中，涉及到許多基因水平的改變，如癌

2、基因的激活和放大，生長因子和(或)其受體的活化等。近年來，有學(xué)者針對膠質(zhì)瘤的代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞通路上的重要靶點(diǎn)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：原發(fā)性GBM患者常有內(nèi)皮生長因子受體(EGFR)的擴(kuò)增和突變、染色體10q雜合性缺失、抑癌基因PTEN變異和P16的缺失等。針對惡性膠質(zhì)瘤癌基因的活化、細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成或遷移相關(guān)的蛋白質(zhì)的過度表達(dá)，許多學(xué)者采用了不同的靶向治療方案，并取得了一些進(jìn)展，顯示了基因靶向治療具有良好的應(yīng)用前景。

3、>　　 USP22基因是近年發(fā)現(xiàn)的BMI-1通路上11個(gè)標(biāo)記基因中的一個(gè)，在人體各組織中均有表達(dá)，表達(dá)量不等，其編碼的蛋白質(zhì)屬于具有泛素特異性修飾酶家族。已有研究表明，BMI-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的包括USP22在內(nèi)的11個(gè)基因具有干細(xì)胞樣表達(dá)模式，在正常干細(xì)胞和部分高度惡性腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，與腫瘤的短期內(nèi)復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和治療耐受密切相關(guān)，符合這種轉(zhuǎn)錄模式的癌癥患者在腫瘤早期就表現(xiàn)出高度惡性的臨床行為。USP22作為能夠早期判斷病情和預(yù)

4、測療效的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記基因之一，其作用逐漸被認(rèn)識(shí)。近年來的研究讓我們有理由推測USP22高表達(dá)可能是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤錯(cuò)綜復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑中的關(guān)鍵點(diǎn)之一，也是潛在的治療靶點(diǎn)。
　　 研究方法
　　 第一部分：通過RT-PCR和westernblot技術(shù)檢測USP22在正常腦組織和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)。
　　 第二部分：將病理證實(shí)為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的組織使用酶消化法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)；設(shè)計(jì)并合成三對siRNA，分別轉(zhuǎn)染

5、原代培養(yǎng)細(xì)胞，通過RT-PCR和westernblot技術(shù)檢測siRNA干擾后USP22的表達(dá)，篩選出干擾效果最佳的一對；用篩選出的siRNA轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)GBM細(xì)胞，利用MTT試驗(yàn)，驗(yàn)證RNA干擾對原代培養(yǎng)細(xì)胞活性的影響；進(jìn)而用流式細(xì)胞儀檢測USP22-specificsiRNA對細(xì)胞周期的影響，并用AnnexinV-FITC和PI雙染色檢測細(xì)胞凋亡情況；初步探索參與GBM細(xì)胞周期調(diào)控的信號(hào)通路。
　　 結(jié)果
　　 1.

6、對GBM患者腫瘤組織以及正常腦組織進(jìn)行比較，采用westernblot和RT-PCR檢測USP22表達(dá)水平。結(jié)果顯示GBM組織中USP22表達(dá)水平較正常對照組明顯增高。
　　 2.原代培養(yǎng)的GBM細(xì)胞在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中貼壁生長，狀態(tài)良好，免疫熒光顯示細(xì)胞內(nèi)GFAP高表達(dá)。
　　 3.設(shè)計(jì)合成的三對USP22-specificsiRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)分別轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞后，

7、細(xì)胞中USP22表達(dá)均下降，其中siRNA-3干擾效果明顯。使用篩選出的siRNA-3轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，設(shè)置轉(zhuǎn)染control-siRNA的細(xì)胞為陰性對照組，MTT法檢測細(xì)胞活性，結(jié)果表明在轉(zhuǎn)染USP22-specificsiRNA后，腫瘤細(xì)胞的增殖被明顯抑制，48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)對應(yīng)的細(xì)胞存活率分別為(65.1±4.3)％，(53.5±5.2)％和(47.2±4.3)％。而陰性對照組轉(zhuǎn)染controlsi

8、RNA后對腫瘤細(xì)胞的增殖沒有明顯的抑制作用。從48小時(shí)起，兩組的細(xì)胞活性存在明顯差異。
　　 4.轉(zhuǎn)染USP22-specificsiRNA不能明顯增加GBM早期凋亡，提示在GBM中USP22通路可能不是調(diào)控其凋亡能力的主要信號(hào)通路。
　　 5.USP22-specificsiRNA作用48小時(shí)可以明顯增加G0/G1期細(xì)胞比例，這提示USP22-specificsiRNA主要通過誘導(dǎo)G1/S期的周期阻滯和增加細(xì)胞死亡來減

9、少GBM增殖。
　　 6.體外實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染USP22-specificsiRNA后，p53、p21和cyclinE的表達(dá)水平較對照組未發(fā)生改變，參與GBM細(xì)胞周期調(diào)控的信號(hào)通路復(fù)雜，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　 結(jié)論
　　 1.膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中USP22表達(dá)在蛋白水平和mRNA水平均較正常腦組織明顯增高。
　　 2.使用酶消化法可獲得生長良好的原代培養(yǎng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光GFPA陽性。