凋亡因子在胰島素抵抗及其干預(yù)組大鼠靶組織中的表達(dá)研究.pdf

1、目的:通過出生當(dāng)日Wistar大鼠注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)建立胰島素抵抗(IR)模型,觀察該模型32周齡時(shí)的凋亡因子在各組織中的表達(dá)情況。采用不同藥物干預(yù)治療,探討凋亡因子表達(dá)對(duì)胰島素抵抗及其干預(yù)組各組織中的表達(dá)情況,以探討其表達(dá)與胰島素抵抗程度的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:出生當(dāng)日Wistar大鼠,通過腹腔注射STZ(90mg／kg)復(fù)制IR模型。常規(guī)伺養(yǎng)至8周齡,符合糖耐量試驗(yàn)餐后2小時(shí)血糖≥

2、11.1mmol／L或空腹血糖≥7.Ommol／L條件者選入本研究。設(shè)立正常對(duì)照組(NC組)、胰島素抵抗對(duì)照組(IR組)、二甲雙胍(MET組)及川芎嗪+氨基胍(TMP+AG組)治療組。
　　 2.空腹血糖(FPG)和空腹胰島素(FINS)檢測(cè):分別于造模第8周和32周斷尾取空腹血,檢測(cè)FPG,留取血清檢測(cè)FINS,根據(jù)公式(FPG·FINS)／22.5計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(IRI)。
　　 3.病理學(xué)檢測(cè):腎組織學(xué)切片行蘇

3、木素-伊紅(HE)染色,觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化。
　　 4.免疫組織化學(xué)染色:觀察腎、肝、腦組織凋亡因子Caspase-3蛋白、Fas蛋白表達(dá)。
　　 5.免疫印記實(shí)驗(yàn)(western blot,WB):觀察腎、肝、腦組織中凋亡因子Caspase-3蛋白、Fas蛋白表達(dá)。
　　 6.反轉(zhuǎn)錄RT—PCR:分別檢測(cè)腎、肝、腦組織Caspase-3、Fas—L和P53的mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　

4、　 1.FPG和FINS檢測(cè)結(jié)果:8周齡時(shí),模型組的FPG、FINS和IRI含量均高于NC組(P<0.01)。用藥24周(32周齡),MET組和TMP+AG組FPG和FINS較IR組進(jìn)一步降低(P<0.01)；MET組和TMP+AG組FPG與NC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,FINS和IRI仍高于NC組。主要指標(biāo)胰島素抵抗指數(shù)變化,IR組明顯高于NC組(P<0.01),MET組和TMP+AG組均明顯低于IR組(p<0.01),且TMP+AG組低

5、于MET組(p<0.05)
　　 2.病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果:HE染色結(jié)果顯示,IR組可見局部輕度系膜細(xì)胞增生,腎小管上皮細(xì)胞核固縮碎裂、細(xì)胞質(zhì)濃縮,嗜酸性增強(qiáng),部分結(jié)構(gòu)消失并分散成多塊；但周圍無(wú)炎癥反應(yīng),腎小管輪廓清晰,基底膜僅剩輪廓。IR組肝組織細(xì)胞表現(xiàn)為核固縮或破碎,嗜酸性增強(qiáng),與周圍細(xì)胞連接松散。IR組腦組織可見神經(jīng)細(xì)胞核深染、固縮、細(xì)胞體積縮小。
　　 3.免疫組化結(jié)果:Caspase-3蛋白在各組肝、腦、腎組織中均有

6、表達(dá),Caspase-3染色主要位于胞漿,呈細(xì)顆粒棕黃色,遠(yuǎn)曲小管(管腔寬而規(guī)則)和近曲小管(管腔狹窄而不規(guī)則)均有表達(dá),以遠(yuǎn)曲小管明顯,腎小球Caspase-3染色陰性。NC組腎組織可見少量陽(yáng)性細(xì)胞,著色淺。IR組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加；MET組和TMP+AG組陽(yáng)性細(xì)胞著色較胰島素抵抗組減少。Fas蛋白相對(duì)在肝、腦組織中表達(dá)較多,在腎組織中表達(dá)較少。Fas蛋白主要表達(dá)在肝組織細(xì)胞的胞膜和胞漿中,肝細(xì)胞胞膜中可見棕色陽(yáng)性物質(zhì)。
　　

7、 4.免疫印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果(western blot,WB):caspase-3蛋白在肝、腦、腎中表達(dá)趨勢(shì)與免疫組化結(jié)果基本一致,在肝、腦、腎各組織中表達(dá)情況如下:NC組中表達(dá)相對(duì)較少,IR組、MET組和TMP+AG組中表達(dá)較NC組均明顯增多(P<0.05),MET組和TMP+AG組均較IR組明顯減低(P<0.05),且TMP+AG組比MET組減少更顯著(P<0.05)。肝組織中Fas的表達(dá)情況:與NC組相比較,IR組和MET組表達(dá)明顯升高

8、(P<0.05)；經(jīng)過藥物干預(yù)后,與IR組比較,MET組和TMP+AG組均減少,但MET組改變沒有差異性(P>0.05),TMP+AG組表達(dá)降低(P<0.05)。
　　 5.反轉(zhuǎn)錄RT—PCR結(jié)果:caspase-3mRNA在肝、腦、腎中表達(dá)趨勢(shì)與免疫組化結(jié)果基本一致,Fas—LmRNA在肝、腦、腎組織中均有表達(dá),其中在肝臟組織表達(dá)最為豐富,情況如下:NC組中表達(dá)相對(duì)較少,IR組、MET組和TMP+AG組中表達(dá)較NC組均明顯增多

9、(P<0.05),MET組和TMP+AG組均較IR組明顯減少(P<0.01),且TMP+AG組比MET組減少更顯著(P<0.05)。P53mRNA在肝、腦、腎組織中均有表達(dá),但是腦組織中表達(dá)較少,與caspase-3mRNA、Fas-LmRNA表達(dá)趨勢(shì)基本一致。
　　 結(jié)論:
　　 1.STZ可以誘導(dǎo)出生當(dāng)日Wistar大鼠產(chǎn)生IR。該模型FPG、FINS、IRI明顯高于正常對(duì)照大鼠。該模型多種組織中不同凋亡因子表達(dá)有明

10、顯改變,提示胰島素抵抗程度的變化與不同凋亡因子表達(dá)改變的參與有關(guān)。
　　 2.MET、TMP+AG組通過二甲雙胍、川芎嗪+氨基胍藥物的干預(yù),可明顯降低胰島素抵抗程度,同時(shí)也下調(diào)caspase-3、FAS蛋白,進(jìn)一步佐證該胰島素抵抗的程度的確與凋亡因子caspase-3、FAS參與有關(guān)。MET、TMP+AG組胰島素抵抗程度與凋亡因子的改變程度不同,以TMP+AG組改變更加明顯,提示川芎嗪+氨基胍干預(yù)過程凋亡因子的影響更大。其確切機(jī)