清道夫受體B族Ⅰ型抑制高價(jià)鐵誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的研究.pdf

1、目的：
　　 通過(guò)觀察清道夫受體（Scavenger receptor class B typeⅠ，SR-BI）基因敲除小鼠脾臟組織中含鐵血黃素的沉積的變化；比較氮基三醋酸鐵（ferric nitrilotriacetate，F(xiàn)e-NTA）誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性對(duì)HepG2（-）細(xì)胞SR-BI蛋白表達(dá)水平的影響；研究SR-BI蛋白的表達(dá)對(duì)Fe-NTA、血紅蛋白（hemoglobin）或高鐵血紅素（hemin）等高價(jià)鐵（Fe3+）誘導(dǎo)的細(xì)

2、胞毒性的影響以及探討Fe-NTA誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的發(fā)生機(jī)制，為SR-BI可以抑制Fe-NTA、Fe-NTA-H2O2、hemoglobin-H2O2和hemin-H2O2等高價(jià)鐵（Fe3+）所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為SR-BI功能研究提供新的關(guān)注點(diǎn)。
　　 方法：
　　 1.SR-BI雜合子（SR-BI+/-）小鼠交配繁殖，篩選SR-BI正常和SR-BI基因敲除小鼠，8-12周齡小鼠麻醉處死，分離摘取脾臟組

3、織，常規(guī)組織切片、HE染色和普魯士藍(lán)染色，顯微鏡下觀察比較兩組小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)、脾臟紅髓中含鐵血黃素（haemosiderin）沉積量的變化。
　　 2.采用蛋白質(zhì)印跡（Western blot）技術(shù)檢測(cè)不同濃度Fe-NTA培養(yǎng)的人肝癌HepG2（-）細(xì)胞中SR-BI蛋白表達(dá)的變化：利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將human-SR-BI-cDNA轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞，篩選建立CHO-SR-BI和CHO-Vector細(xì)胞株。選取2-3

4、代的培養(yǎng)細(xì)胞，分別單獨(dú)給予濃度都為0、0.2、0.4、0.8、1.0mM的Fe-NTA、H2O2，濃度為0、0.8、1.0、2.0mM的NTA，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的變化，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的含量，探討SR-BI蛋白的表達(dá)對(duì)Fe-NTA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響以及NTA、H2O2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　 3.選取2-3代培養(yǎng)的CHO-SR-BI細(xì)胞和CHO-Vecto

5、r細(xì)胞，分別給予0.2mM Fe-NTA培養(yǎng)24小時(shí)和0.05mM Fe-NTA培養(yǎng)48小時(shí)，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)變化，提取細(xì)胞DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳DNA鑒定技術(shù)，檢測(cè)有無(wú)DNA梯狀條帶的形成，探討Fe-NTA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的發(fā)生機(jī)制；分別給予濃度為0、0.2、0.4、0.8、1.0mM的Fe-NTA-H2O2，濃度為0、6.25、12.5、25.0uM血紅蛋白-H2O2、高鐵血紅素-H2O2，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的變化，

6、檢測(cè)CHO-SR-BI細(xì)胞和CHO-Vector細(xì)胞的培養(yǎng)基中LDH的含量，比較SR-BI蛋白的表達(dá)對(duì)上述各種含高價(jià)鐵（Fe3+）混合物所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.HE染色和普魯士藍(lán)染色：與SR-BI正常小鼠相比，SR-BI基因敲除小鼠脾臟紅髓、白髓分布不規(guī)律，紅白髓界限不清，白髓大小不一，尤其是紅髓區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)大量含鐵血黃素的沉積（p<0.05）。
　　 2.在本實(shí)驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Fe

7、-NTA可以誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)非凋亡性的損傷和死亡；蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示Fe-NTA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性對(duì)HepG2（-）細(xì)胞中SR-BI蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響（p>0.05）。
　　 3.H2O2對(duì)于Fe-NTA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性有明顯的增強(qiáng)作用（p<0.05）；給予不同濃度的Fe-NTA、Fe-NTA-H2O2、血紅蛋白-H2O2及高鐵血紅素-H2O2培養(yǎng)后，CHO-SR-BI細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH釋放百分比例顯著低于CHO-Vector

8、細(xì)胞組，兩組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），說(shuō)明細(xì)胞中SR-BI蛋白的表達(dá)可以明顯抑制Fe-NTA、Fe-NTA-H2O2、血紅蛋白-H2O2、高鐵血紅素-H2O2等含高價(jià)鐵（Fe3+）的混合物所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。。
　　 結(jié)論：
　　 1.SR-BI基因敲除小鼠脾臟紅髓、白髓分布不規(guī)律，紅白髓界限不清，白髓大小不一，尤其是紅髓區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)大量含鐵血黃素的沉積。
　　 2.Fe-NTA誘導(dǎo)濃度依賴性的細(xì)胞毒性，