Caveolin-1及B類I型清道夫受體在膿毒癥中的作用.pdf

1、膿毒癥是一種由感染引起的臨床綜合征，是人類死亡的主要原因之一，僅在美國(guó)每年就有約215000人死于膿毒癥，花銷約有167億美元，在世界范圍內(nèi)加重了衛(wèi)生資源的負(fù)擔(dān)。由于人們對(duì)膿毒癥的認(rèn)識(shí)還有很多不足之處，這類疾病的后期病死率極高，超過50％。
　　 膿毒癥機(jī)體全身炎癥狀態(tài)存在兩種不同的免疫反應(yīng)：全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)特點(diǎn)是產(chǎn)生過多促炎性介質(zhì)因子

2、，使機(jī)體早期處于高炎癥反應(yīng)狀態(tài)，而隨后發(fā)生的代償性抗炎癥反應(yīng)綜合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS)則使機(jī)體逐漸轉(zhuǎn)入低炎癥反應(yīng)狀態(tài)。在SIRS發(fā)展到CARS的過程中，機(jī)體內(nèi)促炎性介質(zhì)因子和抗炎性介質(zhì)因子可達(dá)成某種平衡，稱為混合型拮抗反應(yīng)綜合征(mixed antagonistsresponse syndrome，MARS)。SIRS與CARS的失衡或擴(kuò)大化，均會(huì)

3、導(dǎo)致宿主發(fā)生不恰當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)，或因過激的炎癥反應(yīng)或因免疫功能抑制而受到間接傷害。
　　 建立標(biāo)準(zhǔn)化的膿毒癥動(dòng)物模型是探索膿毒癥的病理機(jī)制和預(yù)防干預(yù)的需要。膿毒癥患者最常見的感染源來自腹腔，且造成腹腔內(nèi)感染相對(duì)比較容易，因此腹腔感染模型是目前最常用的膿毒癥動(dòng)物模型。盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation andpuncture，CLP)滿足膿毒癥動(dòng)物模型必備的基本要求：(1)符合膿毒癥典型的高排低阻血流動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)和高代謝狀態(tài)

4、。(2)伴發(fā)多器官功能障礙。(3)較高的自然死亡率。一般要求動(dòng)物模型的自然死亡率達(dá)到50-70％。(4)膿毒癥是嚴(yán)重感染引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)過度激活，從而造成的自我損傷，而不是細(xì)菌和內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體的直接傷害，因此出現(xiàn)器官功能障礙、動(dòng)物死亡應(yīng)該與膿毒癥模型制備有一定的時(shí)間間隔。一般在制模6-12h后發(fā)生的器官功能障礙或死亡屬全身炎癥反應(yīng)所致。因此，用CLP制成動(dòng)物膿毒癥模型，病程同膿毒癥患者類似，制模操作簡(jiǎn)單，適應(yīng)不同研究目的的需要，是目前較

5、為理想的膿毒癥動(dòng)物模型。
　　 研究膿毒癥中涉及的調(diào)節(jié)因素，尤其是內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，是一個(gè)重要的課題。這不僅是對(duì)膿毒癥病理生理機(jī)制的探索，而且對(duì)膿毒癥的有效治療有重大的指導(dǎo)意義。
　　 第一部分
　　 Caveolin-1通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、減少細(xì)菌負(fù)荷、抑制胸腺細(xì)胞凋亡從而對(duì)膿毒癥小鼠起到保護(hù)作用
　　 研究背景：
　　 Caveolae一詞是拉丁語小的凹陷的意思，是脂筏的一種類型，是細(xì)胞膜表面特定

6、的直徑約50-100nm的一個(gè)微型結(jié)構(gòu)區(qū)域，富含膽固醇、鞘磷脂和蛋白質(zhì)。Caveolae不僅含有特殊的脂質(zhì)成分，還含有大量的信號(hào)傳導(dǎo)分子，為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)提供了一個(gè)作用平臺(tái)。
　　 Caveolin-1是一個(gè)24kDa的蛋白，是caveolae的主要組成蛋白，而且被看作是caveolae的標(biāo)記蛋白。Caveolin-1基因的敲除會(huì)導(dǎo)致caveolae的缺失，說明caveolin-1蛋白在caveolae這種特殊結(jié)構(gòu)的組裝過程中發(fā)揮

7、了關(guān)鍵作用。Caveolin-1在多種細(xì)胞生理病理功能方面都發(fā)揮了重要作用：(1)Caveolin-1參與胞吞和吞噬作用；(2)Caveolin-1參與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和胞內(nèi)膽固醇調(diào)節(jié)；(3)Caveolin-1參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)等。因此，人們發(fā)現(xiàn)caveolin-1與多種疾病的發(fā)生發(fā)展都有密切的關(guān)系，如腫瘤、糖尿病和心肺疾病等。
　　 最近有文章報(bào)道caveolin-1參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。但關(guān)于caveolin-1的這項(xiàng)功能，不

8、同的文章有看似相反的報(bào)道。用細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激作為內(nèi)毒素血癥的模型，人們觀察到caveolin-1敲除小鼠更能耐受LPS引起的炎癥性肺損傷。但用傷寒沙門氏菌或銅綠假單胞菌刺激小鼠，caveolin-1敲除小鼠則表現(xiàn)出較高的死亡率。這些研究證明caveolin-1對(duì)LPS和細(xì)菌感染的反應(yīng)是不一樣的，而且以上研究所用的炎癥模型都不能較好地模擬臨床。內(nèi)毒素血癥和膿毒癥的病理生理改變有相當(dāng)大的區(qū)別，我

9、們發(fā)現(xiàn)至今尚無有關(guān)caveolin-1和膿毒癥關(guān)系的報(bào)道。因此，利用合適的動(dòng)物模型來研究caveolin-1在膿毒癥中所起作用是一個(gè)非常有意義的課題。這不僅能得出更為貼近臨床的結(jié)論，而且也為膿毒癥的干預(yù)提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。
　　 研究目的：
　　 探索caveolin-1對(duì)動(dòng)物膿毒癥病程的影響及研究此影響的具體機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 我們用CLP作為膿毒癥模型研究caveolin-1在多種微生物引起

10、的膿毒癥中的作用。首先我們觀察caveolin-1敲除小鼠和野生型小鼠在CLP術(shù)后5天的死亡率并觀察到了一定差別。然后我們分別從以下4個(gè)方面探索caveolin-1的作用機(jī)制：(1)衡量caveolin-1對(duì)CLP引起的肺損傷的影響。我們檢測(cè)CLP術(shù)后20h兩組小鼠肺臟髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，稱量肺濕重和干燥后的肺干重，計(jì)算肺濕/干重比來評(píng)估肺水腫，利用分離-灌注肺臟模型檢測(cè)肺臟毛細(xì)血管膜通透性。(2

11、)衡量caveolin-1對(duì)CLP引起的炎癥反應(yīng)的影響。兩組小鼠施以CLP，術(shù)后2h、4h、8h、20h時(shí)取小鼠血清測(cè)量血清中腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)，白介素-6(interleukin-6，IL-6)和亞硝酸鹽/硝酸鹽(nitrite/nitrate，NOx)水平。(3)衡量caveolin-1對(duì)CLP術(shù)后機(jī)體含菌量的影響。兩組小鼠施以CLP，術(shù)后20h時(shí)檢測(cè)小鼠血液、肝臟和脾臟中的

12、細(xì)菌含量。(4)衡量caveolin-1對(duì)CLP后淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和凋亡的影響。兩組小鼠施以CLP，術(shù)后18h時(shí)分離小鼠胸腺和脾臟，用流式細(xì)胞術(shù)分析組織中淋巴細(xì)胞表型，并用Annexin V/PI和UNEL兩種方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：
　　 (1)Caveolin-1對(duì)膿毒癥小鼠有保護(hù)作用。CLP導(dǎo)致caveolin-1敲除小鼠67％的死亡率，但野生型小鼠死亡率只有27％。(2)Caveolin-1對(duì)CLP引起的肺損

13、傷無明顯影響。兩組小鼠肺MPO活性，肺水腫和肺毛細(xì)血管膜通透性無明顯差別。(3)Caveolin-1敲除小鼠在膿毒癥時(shí)炎癥反應(yīng)失控。CLP后野生型小鼠表現(xiàn)出典型的急性期反應(yīng)，TNF-α和IL-6在膿毒癥早期(2-4h)大量產(chǎn)生然后在接下來的時(shí)間水平逐漸降低。但與野生型小鼠不同，caveolin-1敲除小鼠在膿毒癥期間炎癥因子的生成水平一直很高，血清TNF-α、IL-6和NOx水平在CLP術(shù)后4h內(nèi)持續(xù)升高，并且在.20h時(shí)比野生型小鼠高

14、3-4倍。(4)Caveolin-1敲除小鼠在膿毒癥時(shí)有較高的細(xì)菌負(fù)荷。Caveolin-1敲除小鼠血液、肝臟、脾臟中均表現(xiàn)出較高的含菌量。(4)膿毒癥時(shí)caveolin-1敲除小鼠胸腺細(xì)胞凋亡增多，淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡。Caveolin-1敲除小鼠胸腺細(xì)胞凋亡明顯增多，表現(xiàn)為Annexin、V+/PI-和TUNEE+的胸腺細(xì)胞均有2倍增加。而且胸腺和脾臟中淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡，細(xì)胞亞群比例失調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Cav

15、eolin-1對(duì)膿毒癥小鼠起到了保護(hù)作用，降低膿毒癥小鼠的死亡率。
　　 2.Caveolin-1抗膿毒癥的作用是通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、減少細(xì)菌負(fù)荷、抑制胸腺細(xì)胞凋亡等來實(shí)現(xiàn)的。
　　 3.CLP是較為理想的膿毒癥動(dòng)物模型。
　　 研究意義：
　　 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于采用一種更好地模擬臨床的膿毒癥動(dòng)物模型來驗(yàn)證了caveolin-1在膿毒癥中的作用，并從多角度多方面深入探索了作用機(jī)制。進(jìn)一步證明了炎癥是一個(gè)牽

16、涉多器官組織的復(fù)雜的過程，涉及機(jī)制繁多。而caveolin-1通過干預(yù)多種途徑對(duì)膿毒癥動(dòng)物起到保護(hù)作用，這也為膿毒癥的臨床干預(yù)提供了一個(gè)嶄新的靶點(diǎn)，并為進(jìn)一步研究指出了方向。
　　 第二部分B類Ⅰ型清道夫受體通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)對(duì)膿毒癥小鼠起保護(hù)作用
　　 研究背景：
　　 B類Ⅰ型清道夫受體(scavenger receptor BI，SR-BI or Scarb1)是清道夫受體家族的一員，是一個(gè)75kDa的位于細(xì)

17、胞膜caveolae里的膜蛋白。SR-BI分布廣泛，主要在肝臟及生成類固醇激素的組織中高度表達(dá)，如腎上腺、睪丸、卵巢等。在巨噬細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞上也都有表達(dá)。SR-BI是目前公認(rèn)的HDL受體，介導(dǎo)了HDL轉(zhuǎn)運(yùn)的膽固醇酯選擇性地?cái)z入細(xì)胞內(nèi)，參與了膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程。除此之外，SR-BI還具有多種重要的生理功能：(1)SR-BI介導(dǎo)的內(nèi)流的膽固醇是合成類固醇類激素的重要原料；(2)血漿中HDL與血管內(nèi)皮細(xì)胞上

18、SR-BI結(jié)合，可以激活共同位于caveolae里的內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide，NO)，發(fā)揮舒張血管等心血管保護(hù)作用；(3)SR-BI抑制過量NO產(chǎn)生的細(xì)胞毒性；(4)在沒有配體與SR-BI結(jié)合的情況下，SR-BI能通過激活caspase-8誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；
　　 最近有文章報(bào)道SR-BI有抗LPS引起的動(dòng)物死亡的作用

19、。其保護(hù)作用來源于SR-BI抑制NO誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和SR-BI介導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素合成。這些研究提示了SR-BI可能會(huì)在膿毒癥中發(fā)揮一定作用。鑒于內(nèi)毒素血癥并不能很好地模擬臨床，采用合適的膿毒癥動(dòng)物模型來發(fā)掘SR-BI在炎癥中的作用是一個(gè)十分必要的課題。這不僅能夠更好地得出延伸至臨床的結(jié)論，而且也為膿毒癥的診治提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。
　　 研究目的：
　　 研究SR-BI在動(dòng)物膿毒癥中的作用并探索其作用機(jī)制。
　　 研

20、究方法：
　　 我們采用CLP作為膿毒癥動(dòng)物模型，觀察SR-BI敲除小鼠和野生型小鼠在CLP后的死亡率，并觀察到了一定的差別。接下來我們采用以下步驟來探索其中的機(jī)制：(1)衡量SR-BI對(duì)CLP后炎癥反應(yīng)的影響。兩組小鼠施以CLP，術(shù)后2h、4h、8h、20h時(shí)測(cè)量小鼠血清中TNF-α，IL-6和NOx水平。(2)衡量SR-BI介導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素合成在膿毒癥中的作用。兩組小鼠施以CLP，術(shù)后2h、4h、8h、20h時(shí)測(cè)量小鼠血清中

21、皮質(zhì)酮水平，以及在小鼠施以CLP之前8h在飲用水中添加皮質(zhì)酮，觀察CLP后小鼠的死亡率。(3)衡量SR-BI對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生的影響。我們培養(yǎng)兩組小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞，并用LPS刺激，檢測(cè)分泌的TNF-α和IL-6水平。(4)衡量SR-BI在巨噬細(xì)胞上的表達(dá)是否與膿毒癥小鼠的死亡率有相關(guān)關(guān)系。我們之前的研究證明第323位氨基酸C突變?yōu)镚的SR-BI(SR-BIC323G)已經(jīng)喪失了SR-BI的基本功能，包括攝取膽固醇、調(diào)節(jié)類固醇激

22、素合成、誘導(dǎo)凋亡、抗NO毒性。因此SR-BIC323G轉(zhuǎn)基因小鼠是一個(gè)良好的用來研究SR-BI未知作用的模型。我們用SR-BI敲除背景的SR-BIC323G轉(zhuǎn)基因小鼠和未轉(zhuǎn)基因小鼠來再一次確定SR-BI對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及這個(gè)影響與小鼠的死亡率的關(guān)系。(5)衡量SR-BI對(duì)toll樣受體4(toll-like receptor4，TLR4)介導(dǎo)的NF-κB激活的影響。HEK-Blue細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)TLR4、CD14、MD2和NF-κ

23、B啟動(dòng)子。LPS激活TLR4，導(dǎo)致NF-KB啟動(dòng)子的表達(dá)，然后能催化HEK-Blue檢測(cè)液變藍(lán)。藍(lán)色的深淺用650nm處的吸光值來定量檢測(cè)。我們制備穩(wěn)定表達(dá)野生型SR-BI、SR-BIC323G和pLNCX2質(zhì)粒的HEK-Blue細(xì)胞系，用0、0.5、1、2 ng/ml的LPS刺激16h后檢測(cè)NF-κB的激活。(6)衡量SR-BI在膿毒癥時(shí)對(duì)脂蛋白的影響。兩組小鼠施以CLP，術(shù)后20h時(shí)采血，用快速蛋白液相色譜分析血清脂蛋白分型。(7)

24、衡量SR-BI在膿毒癥時(shí)對(duì)血漿LPS清除的影響。兩組小鼠施以CLP，術(shù)后4h、8h、20h時(shí)取血檢測(cè)血漿LPS水平。
　　 結(jié)果：
　　 (1)SR-BI對(duì)膿毒癥小鼠有保護(hù)作用。在CLP后72h時(shí)SR-BI敲除小鼠的死亡率是100％，而野生型小鼠的死亡率只有21％。(2)膿毒癥時(shí)SR-BI敲除小鼠固有免疫反應(yīng)異常。野生型小鼠表現(xiàn)出典型的急性期反應(yīng)，TNF-α和IL-6在膿毒癥早期(2-8h)大量產(chǎn)生然后在接下來的時(shí)間水平

25、逐漸降低。與野生型小鼠不同，SR-BI敲除小鼠在CLP后4h時(shí)血清TNF=α和IL-6水平水平較低，說明膿毒癥早期SR-BI敲除小鼠炎癥反應(yīng)延遲。而且在20h時(shí)SR-BI敲除小鼠血清TNF-α和IL-6水平持續(xù)升高，說明膿毒癥晚期SR-BI敲除小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)失控性持續(xù)發(fā)展。NOx的反應(yīng)類似。(3)SR-BI介導(dǎo)的皮質(zhì)酮合成對(duì)膿毒癥小鼠的死亡率無明顯影響。補(bǔ)充皮質(zhì)酮對(duì)CLP引起的膿毒癥的SR-BI敲除小鼠并無保護(hù)作用。(4)SR-BI調(diào)

26、節(jié)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。在LPS刺激下，野生型巨噬細(xì)胞生成的TNF-α在4h達(dá)到最大值，IL-6在8h達(dá)到最大值。但是SR-BI敲除巨噬細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生TNF-α和IL-6，在20h時(shí)水平超過野生型巨噬細(xì)胞。說明無SR-BI表達(dá)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)失控。(5)巨噬細(xì)胞上SR-BI的表達(dá)是降低膿毒癥小鼠死亡率的原因之一。與未轉(zhuǎn)基因的巨噬細(xì)胞相比，SR-BIC323G轉(zhuǎn)基因的巨噬細(xì)胞上SR-BIC323G的表達(dá)顯著抑制TSF-α和IL-6的產(chǎn)生。并

27、且CLP后SR-BIC323G轉(zhuǎn)基因小鼠死亡率明顯較低。(6)SR-BI調(diào)節(jié)TLR4介導(dǎo)的NF-κB激活。SR-BI的存在顯著地抑制了LPS刺激下NF-κB的激活，說明SR-BI能調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。(7)膿毒癥期間SR-BI對(duì)脂蛋白無明顯影響。(8)膿毒癥時(shí)SR-BI加速了LPS的清除。CLP后20h時(shí)SR-BI敲除小鼠血漿LPS水平比野生型小鼠較高，而且在膿毒癥早期SR-BI敲除小鼠血漿LPS水平比野生型小鼠較低

28、，說明SR-BI同時(shí)參與了LPS從炎癥部位吸收入血和從血中清除兩個(gè)過程。
　　 結(jié)論：
　　 1.SR-BI對(duì)膿毒癥小鼠是一個(gè)重要的保護(hù)性因子，有效降低膿毒癥小鼠的死亡率。
　　 2.SR-BI抗膿毒癥的作用是通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和促進(jìn)LPS清除來實(shí)現(xiàn)的。
　　 3.CLP是較為理想的膿毒癥動(dòng)物模型。
　　 研究意義：
　　 本實(shí)驗(yàn)采用了一種更能模擬臨床膿毒癥患者病程的動(dòng)