一種大鼠肝癌干細胞的離心富集方法.pdf

1、近年來，腫瘤干細胞（Cancer Stem Cells, CSCs）假說在相關領域掀起了巨大的騷動，此學說認為：腫瘤是由其自身的干細胞所維持的。這群細胞或者處于休眠狀態(tài)或者不斷的分裂出腫瘤細胞導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，也參與了腫瘤耐藥、復發(fā)和轉移的機制。進一步的了解CSCs的特點將有助于早期預防腫瘤發(fā)生和增加腫瘤治療方法的選擇性。近幾年從多種腫瘤中成功的分離出CSCs，比如乳腺癌、前列腺癌、腦癌和結腸癌等等，盡管如此，干細胞的存在與否仍然是

2、個備受爭議的話題。
　　肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是一種高度惡性腫瘤，因其轉移早，預后差，如何治療HCC是醫(yī)學界的一大世界性難題。肝癌干細胞（Hepatic cancer stem cells, HCSCs）是體外研究治療策略的非常好的模型，正是如此，HCSCs的分離與鑒別是至關重要的，只有獲得了純正的HCSCs，后續(xù)的研究才有可信度。目前常用的分選HCSCs的方式種類繁多，主要是針對其

3、表面分子標志物的識別如CD133和EpCAM，應用熒光活化細胞分選系統(tǒng)（Fluorescence-activated Cell Sorting, FACS）及磁性活化細胞分選系統(tǒng)（Magnetic-activated Cell Sorting, MACS）來分選，然而，分選HCSCs的標志物特異性是有爭議的。為了彌補這個缺憾，有不少學者嘗試利用干細胞能夠將熒光染料Hoechst33342或者羅丹明123外排的特性，通過FACS篩選出邊緣

4、群（Side Population, SP）細胞的方法富集HCSCs，此方法非常有效，但是最近的研究表明，染料Hoechst33342可損傷細胞以致影響實驗的準確性，以及SP細胞的假陽性，這些都限制了該方法的廣泛應用。因此我們選擇了另外一種方法，即密度梯度離心。根據(jù)前期我實驗室建立的分離胎肝干/祖細胞(Fetal Liver Stem/Progenitor Cells, FLSPCs)的三步分離法，我們以改進的設計進行大鼠HCSCs的分

5、離。
　　研究目的：
　　基于 HCSCs的物理特性，使用Percoll連續(xù)密度梯度離心方法富集HCSCs，并通過細胞形態(tài)學、功能學等方法檢測其是否具有干性，最后以非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠（Non-Obese Diabetic mice with Severe Combined Immunodeficiency Disease, NOD/SCID mice）成瘤實驗來驗證所分選細胞的致瘤能力。
　　研究方法：

6、
　　F334大鼠行二乙基亞硝胺（Diethylnitrosamine, DENA）腹腔注射建立肝癌模型，確認成癌后提取原代肝癌細胞并體外培養(yǎng)，經(jīng)過差速消化法初步純化細胞，擴增至足量后行Percoll連續(xù)密度梯度離心，根據(jù)密度指示珠標識將細胞分為四層并繼續(xù)培養(yǎng)。
　　首先將所分選細胞分別行透射電鏡、鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞的形態(tài)，并做AFP和CK-19免疫熒光染色確定細胞來源。其次通過流式細胞術和熒光實時定量檢測各層細胞的CSC

7、s標記水平。繼而通過繪制生長曲線、Transwell實驗檢驗各層細胞的增殖、遷移和侵襲能力，最后行NOD/SCID小鼠成瘤實驗檢測細胞的致瘤能力。
　　研究結果：
　　Percoll離心所得四層細胞，由AFP和CK-19免疫熒光染色可知均為肝細胞性肝癌來源；透射電鏡、鬼筆環(huán)肽染色發(fā)現(xiàn)第3層細胞有干細胞的形態(tài)表現(xiàn)，且纖毛和偽足較多；生長曲線、侵襲實驗均可見第3層細胞具有最強的增殖、遷移和侵襲能力；流式細胞術得出第3層細胞EpC

8、AM與AFP陽性表達最高，分別為（84.5±8.31）％和（85.2±8.31）％；Realtime-PCR證實，第3層細胞的EpCAM和AFP的mRNA表達最高，分別為（111.34±5.59）和（13.76±0.95），第3層的CD133表達為（17.16±0.42），與第2層、4層差異有統(tǒng)計學意義，但與第1層差異無統(tǒng)計學意義；NOD/SCID小鼠成瘤實驗顯示，1×104個/ml濃度的第3層細胞成瘤率為100％，且成瘤最早、體積最大

9、，移植瘤鏡下顯示為腫瘤細胞且來源為肝細胞性肝癌，同時觀察到肝臟也受到了不同程度的侵害，充分說明了此層細胞的致瘤能力強，并可能歸巢性的損傷了肝臟。
　　研究結論及意義：
　　利用Percoll連續(xù)密度梯度離心從原代培養(yǎng)的大鼠肝癌細胞中分離出的第3層細胞，形態(tài)學上與CSCs相似，功能學中增殖、侵襲和致瘤能力均強于其他層腫瘤細胞，經(jīng)過證實，此層細胞就是我們所需要的HCSCs。
　　該實驗方法與表面標志分選相比，雖然精度稍差，