hMLH1基因甲基化對甲狀腺乳頭狀癌進(jìn)展的影響及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、作為最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，近20年來，甲狀腺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)迅速上升，而且女性的發(fā)病率明顯高于男性。甲狀腺癌分為乳頭狀癌、濾泡癌、未分化癌和髓樣癌四種類型。其中甲狀腺乳頭狀癌(Papillary ThyroidCarcinoma PTC)是發(fā)病率最高的一種，約占59.9～89.0％。它的發(fā)病機(jī)制尚不明確?？赡芘c基因改變、激素作用、環(huán)境作用如放射線照射等有關(guān)。目前研究結(jié)果表明甲狀腺乳頭狀癌與RAS、BRAFV600E點突變和R

2、ET/PTC重排;抑癌基因CDH1，PTEN和RASSF1基因啟動子甲基化，碘代謝相關(guān)基因TSHR和NIS啟動子的甲基化，以及各種microRNA的上調(diào)，或下調(diào)有關(guān)。
　　 人類錯配修復(fù)基因hMLH1的表達(dá)產(chǎn)物，hMLH1蛋白是人類DNA錯配修復(fù)途徑的重要組成部分。在人類DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)中，hMLH1基因的表達(dá)產(chǎn)物通過聯(lián)合PMS2協(xié)同介導(dǎo)MSH2及其它有功能的修復(fù)酶與錯配基因結(jié)合，增強(qiáng)修復(fù)效能，但hMLH1蛋白本身并不直接參與

3、錯配修復(fù)。該基因的失活hMLH1基因的失活與大腸癌、胃癌、食管癌、腎細(xì)胞癌、宮頸癌、胰腺癌的發(fā)生有關(guān)。
　　 鈉碘同向轉(zhuǎn)運體(sodium iodide symporter NIS)及促甲狀腺激素受體（thyroid-stimulating hormone receptor TSHR）是甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞、癌細(xì)胞攝碘過程中的關(guān)鍵基因。表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，如小RNA、DNA甲基化、組蛋白修飾等都影響著NIS、TSHR的表達(dá)量。缺乏

4、或異位表達(dá)NIS可能導(dǎo)致甲狀腺癌細(xì)胞攝取放射碘能力降低，導(dǎo)致較差的預(yù)后。促甲狀腺激素(thyroid-stimulatinghormone TSH)和TSHR亦可調(diào)控NIS的表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄后至細(xì)胞膜的靶向運輸。因此，TSHR和NIS自身的合成代謝及翻譯后細(xì)胞內(nèi)定位似乎受到對方直接或間接的調(diào)控，但目前尚缺乏相關(guān)研究。
　　 DNA啟動子甲基化是基因組表觀調(diào)控最重要的組成部分，主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)。由于年齡、代謝、環(huán)境等多種因

5、素均能影響DNA甲基化，故而DNA啟動子的異常甲基化存在于幾乎所有惡性腫瘤中。由于腫瘤相關(guān)基因的啟動子和基因組的異常甲基化可以隨壞死腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血體液，因此還可以通過檢測血清、血漿、尿液、腹水等體液內(nèi)的異常甲基化來間接反應(yīng)組織的甲基化情況，并有望成為一種有效的腫瘤分子標(biāo)志物。
　　 本項研究旨在利用熒光定量甲基化特異性PCR(MSP)檢測152例甲狀腺乳頭狀癌及癌旁正常組織中hMLH1基因啟動子區(qū)5'-CpG島的甲基化情況，

6、探討癌組織中該基因甲基化水平與各項臨床病理因素之間的相關(guān)性。并進(jìn)一步通過結(jié)合碘代謝相關(guān)基因NIS、TSHR在甲狀腺乳頭狀癌組織中的甲基化數(shù)據(jù)，分析hMLH1基因甲基化和碘代謝相關(guān)基因甲基化之間的關(guān)系，從而探討hMLH1基因甲基化在甲狀腺乳頭狀癌中可能的作用機(jī)制。
　　 本研究由三部分組成:
　　 第一部分甲狀腺乳頭狀癌中hMLH1基因啟動子區(qū)5'-CpG島的異常甲基化及其臨床意義研究。
　　 目的:
　　

7、 檢測在甲狀腺乳頭狀癌中hMLH1基因啟動子甲基化的狀態(tài)，并探討其異常甲基化與臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　 方法:
　　 采用實時熒光甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(real-time methylation-specificPCR，MSP)分別檢測152例PTC患者癌及癌旁正常組織中hMLH1基因啟動子區(qū)域5'-CpG島甲基化狀況，并分析其與各臨床病理特征參數(shù)之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 1.在癌組織中

8、hMLH1基因甲基化的百分率為37.5％(57/152)，顯著高于癌旁正常組織的5.3％(8/152)(p＜0.0001)。
　　 2.所有PTC病例中，腫瘤原發(fā)灶最大徑大于等于2cm病例的hMLH1基因甲基化陽性百分率為48.1％(26/54)明顯高于原發(fā)灶最大徑小于2cm病例的31.6％(31/98)(p=0.044);
　　 3.多發(fā)病灶的甲狀腺乳頭狀癌病例甲基化陽性率為47.3％(35/74)也明顯高于單發(fā)病灶病

9、例的28.2％(22/78)(p=0.015);
　　 4.腫瘤腺外侵犯組的甲基化陽性率為45.3％(34/75)，亦明顯高于局限限內(nèi)的29.9％(23/77)(p=0.049);
　　 5.頸淋巴轉(zhuǎn)移組的hMLH1基因甲基化陽性率為46.2％(36/78)，明顯高于無頸淋巴轉(zhuǎn)移組的28.4％(21/74)(p=0.024);
　　 6.較晚的T分期患者(T3/T4) hMLH1基因甲基化陽性百分率為45.7％(

10、37/81)明顯高于較早的T分期患者(T1/T2)28.2％(20/71);
　　 7.本組病例中發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的2例均存在甲基化，比例大大高于無轉(zhuǎn)移組，但是由于例數(shù)太少，統(tǒng)計結(jié)果無意義;
　　 8.關(guān)于年齡對甲基化的影響，若以對PTC臨床分期最有意義的45歲分組，甲基化分布無明顯差別(p=0.151)，但若以60歲分組，60歲以上組的甲基化陽性率(70.6％5/12)明顯高于60歲以下組(33.3％45/90)(p=0.

11、003);
　　 9.而在本次研究中，性別、病理分期等因素與hMLH1甲基化無關(guān)(p值均＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 hMLH1基因啟動子的異常甲基化在甲狀腺乳頭狀癌病例中十分常見，與甲狀腺乳頭狀癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。
　　
　　 第二部分甲狀腺乳頭狀癌中碘代謝相關(guān)基因NIS、TSHR啟動子區(qū)的異常甲基化研究。
　　 目的:
　　 檢測碘代謝相關(guān)基因NIS、TSHR啟動子

12、在甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中甲基化的狀態(tài)
　　 方法:
　　 采用實時熒光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Methylation specificpolymerase chain reaction，MSP)分別檢測152例PTC患者癌及癌旁正常組織中碘代謝相關(guān)基因NIS、TSHR啟動子區(qū)域5'-CpG島的甲基化狀況。
　　 結(jié)果:
　　 1.在癌組織中NIS基因甲基化的百分率為52.6％(80/152)，顯

13、著高于癌旁正常組織的7.2％(11/152)(p＜0.0001)。
　　 2.在癌組織中TSHR基因甲基化的百分率為30.9％(47/152)，顯著高于癌旁正常組織的6.58％(10/152)(p＜0.0001)。
　　 結(jié)論:
　　 碘代謝相關(guān)基因NIS、TSHR啟動子的異常甲基化在甲狀腺乳頭狀癌病例中十分常見，提示這兩個基因與甲狀腺乳頭狀癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移等有關(guān)。
　　 第三部分甲狀腺乳頭狀癌中hMLH1基

14、因異常甲基化和碘代謝相關(guān)基因NIS、TSHR異常甲基化的相關(guān)性分析。
　　 目的:
　　 通過分析甲狀腺乳頭狀癌中hMLH1、NIS、TSHR基因啟動子異常甲基化之間的相關(guān)性，來探討hMLH1基因啟動子異常甲基化在甲狀腺乳頭狀癌進(jìn)展中的可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 采用Pearson相關(guān)性分析來評估hMLH1基因的異常甲基化和NIS、TSHR基因異常甲基化百分率之間的相關(guān)性。采用二項logistic回歸

15、分析hMLH、TSHR、NIS基因異常甲基化在單獨及協(xié)同作用下對甲狀腺乳頭狀癌各臨床病理參數(shù)的相對風(fēng)險值OR、95％置信區(qū)間及相應(yīng)P值來評估各基因的異常甲基化對臨床病理參數(shù)的獨立、協(xié)同影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.在癌組織中hMLH1與TSHR、hMLH1與NIS、TSHR與NIS異常甲基化之間的相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.287、0.318、0.369，且p值均＜0.0001.。提示hMHL1、TSHR、NIS三基因的異

16、常甲基化不存在相關(guān)性。
　　 2.二項logistic回歸分析結(jié)果顯示hMLH1基因甲基化陽性時臨床分期為Ⅲ/Ⅳ的風(fēng)險為hMLH1基因甲基化陰性時的77.034倍(95％CI:1.616-3671.567)，且p=0.028。模型中剩余的各協(xié)變量p值均＞0.05。提示hMLH1基因甲基化是較高臨床分期的風(fēng)險因素之一，且該因素和TSHR、NIS基因甲基化之間不存在協(xié)同作用。
　　 3.二項logistic回歸分析結(jié)果顯示h

17、MLH1基因甲基化陽性時原發(fā)灶大小≥2cm的風(fēng)險為hMLH1基因甲基化陰性時的35.445倍(95％CI:1.008-1245.983)，且p=0.049。模型中剩余的各協(xié)變量p值均＞0.05。提示hMLH1基因甲基化是較大原發(fā)灶的風(fēng)險因素之一，且該因素和TSHR、NIS基因甲基化之間不存在協(xié)同作用。
　　 4.二項logistic回歸分析結(jié)果顯示TSHR基因甲基化陽性時腺外侵犯的風(fēng)險為TSHR基因甲基化陰性時的209.068倍

18、(95％CI:6.415-6813.598)，且p=0.003。模型中剩余的各協(xié)變量P值均＞0.05。提示TSHR基因甲基化是腺外侵犯的風(fēng)險因素之一，且hMLH1基因和TSHR、MIS基因甲基化之間不存在協(xié)同作用。
　　 5.二項logistic回歸分析結(jié)果顯示TSHR基因甲基化陽性時T分期為T3/T4的風(fēng)險為TSHR基因甲基化陰性時的260.458倍(95％CI:7.044-9629.97)，且p=0.003。模型中剩余的各協(xié)

19、變量p值均＞0.05。提示TSHR基因甲基化是較高T分期的風(fēng)險因素之一，且hMLH1基因和TSHR、NIS基因甲基化之間不存在協(xié)同作用。
　　 6.二項logistic回歸分析結(jié)果顯示TSHR基因甲基化陽性時淋巴轉(zhuǎn)移的風(fēng)險為TSHR基因甲基化陰性時的36.844倍(95％CI:0.980-1385.201)，且p=0.051。模型中剩余的各協(xié)變量p值均＞0.05。提示TSHR基因甲基化可能是淋巴轉(zhuǎn)移的風(fēng)險因素之一，且hMLH1基

20、因和TSHR、NIS基因甲基化之間不存在協(xié)同作用。
　　 7.二項logistic回歸分析結(jié)果顯示hMLH1基因甲基化不是原發(fā)灶數(shù)量的風(fēng)險因素，且他和TSHR、NIS基因甲基化之間不存在協(xié)同作用。
　　 結(jié)論:
　　 hMHL1、TSHR、NIS三基因的異常甲基化不存在相關(guān)性。hMLH1基因啟動子的異常甲基化是較高臨床分期和較大原發(fā)灶大小的風(fēng)險因子。TSHR基因啟動子的異常甲基化是較高T分期和腺外侵犯的風(fēng)險因子。