傷寒沙門菌RcsB負(fù)性調(diào)控鞭毛抗原基因fljB：z66的表達(dá).pdf

1、目的：探討調(diào)節(jié)因子RcsB對傷寒沙門菌H：z66鞭毛抗原編碼基因fljB：z66表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 方法：采用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法制備傷寒沙門菌的調(diào)節(jié)因子RcsB的基因缺陷變異株rcsB-，根據(jù)傷寒沙門菌rcsB基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增rcsB基因上、下游同源性片段，定向連接成rcsB基因缺損型同源核苷酸片段，并與自殺質(zhì)粒pGMB151相連后經(jīng)電擊法導(dǎo)入傷寒沙門菌野生株，進(jìn)行同源重組，通過篩選獲得rcsB-；采用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的

2、同源重組方法制備傷寒沙門菌的z66鞭毛抗原基因的β-半乳糖苷酶插入變異株fljB：lacZ，設(shè)計(jì)加接Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位點(diǎn)的特異性引物，用PCR擴(kuò)增獲得fljB基因的上、下游同源性DNA片段，并與用Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ酶切pSV-β-galactosidase vector的片段定向連接，并克隆至自殺質(zhì)粒pGMB151的Barn HI，再通過電擊法轉(zhuǎn)入傷寒沙門菌野生株及rcsB-缺陷株，在含X-Gal的蔗糖平板上篩選獲得同源重

3、組變異株fljB：lacZ和rcsB-fljB：lacZ；分別在低滲(50mmol/L，NaCl)、高滲(300mmol/L NaCl)LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)沙門菌野生菌株及rcsB-缺陷株，通過熒光實(shí)時定量RT-PCR觀察力fljB：z66在不同滲透壓條件下的mRNA水平；分別在低滲、高滲LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)fljB：lacZ和rcsB-fljB：lacZ，通過測定β-半乳糖苷酶LacZ的活性來觀察傷寒沙門菌在不同滲透壓條件下fljB：

4、z66翻譯水平的表達(dá)。 結(jié)果：PCR及序列分析證實(shí)，rcsB變異株中rcsB基因372bp被14bp取代，表明成功構(gòu)建rcsB缺陷株；PCR及序列分析證實(shí)變異株中fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代，表明成功構(gòu)建fljB：：lacZ和rcsB-fljB：：lacZ變異株；通過熒光實(shí)時定量RT-PCR測定，發(fā)現(xiàn)在高滲和低滲條件下rcsB缺陷株的mRNA水平表達(dá)比野生株顯著增高；通過β-半乳糖苷酶測定，發(fā)現(xiàn)在高