基于代謝途徑的前體對(duì)美伐他汀生物合成的影響.pdf

1、他汀類藥物通過對(duì)HMG-CoA(3-hydroxy-3-methylglutaryl-cocnzyrne-A)還原酶的競(jìng)爭性抑制，有效地降低內(nèi)源性膽固醇的合成，同時(shí)又代償性增加臟器細(xì)胞內(nèi)低密度脂蛋白受體(LDLR)的合成，提高對(duì)血液中低密度脂蛋白(LDL)的攝取，降低血液中總膽固醇的含量。作為治療高膽固醇血癥及其相關(guān)疾病的一線藥物，是排名前列的全球暢銷藥。美伐他汀是最早發(fā)現(xiàn)的他汀類物質(zhì)，隨后通過對(duì)其結(jié)構(gòu)類似物的尋找，發(fā)現(xiàn)了全球第一個(gè)通過

2、FDA批準(zhǔn)上市的HMG-CoA還原酶抑制劑藥物洛伐他汀，另外美伐他汀還是普伐他汀的直接底物，所以雖然最終美發(fā)他汀沒有成為藥物，但它在他汀藥物發(fā)展上的重要性不可忽視，而且長期作為生物轉(zhuǎn)化底物、原料藥和添加劑占領(lǐng)市場(chǎng)。 美伐他汀生物合成基因簇及假想的生物合成途徑的公布，表明美伐他汀的是一類典型的聚酮類化合物，為提高其生物合成產(chǎn)量提供了新的思路和依據(jù)。大量實(shí)驗(yàn)表明，適宜的前體能有效地增加聚酮類化合物的產(chǎn)量。 本文對(duì)一株疑似產(chǎn)美

3、伐他汀的真菌IMBM21進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子鑒定，通過薄層色譜(TLC)、紫外掃描(UV scanning)、高效液相色譜(HPLC)和液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)的化學(xué)篩選方法對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，確定產(chǎn)物為美伐他汀。對(duì)IMBM21基本培養(yǎng)條件進(jìn)行研究后，基于美伐他汀生物合成的代謝途徑，選擇短鏈脂肪酸、豆油、三羧酸(TCA)循環(huán)中間體和氨基酸4類在微生物生命活動(dòng)中具有不同代謝途釋的前體，研究前體物質(zhì)對(duì)IMBM21產(chǎn)生的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物美伐他汀生物

4、合成的影響，旨在為工業(yè)生產(chǎn)美伐他汀尋找適宜的前體物質(zhì)，也為深入研究IMBM21菌株的代謝調(diào)控提供基礎(chǔ)研究信息。 IMBM21在葡萄糖馬鈴薯(PDA)甘油培養(yǎng)基上生長，菌落顏色隨培養(yǎng)時(shí)間的延長由桔黃變?yōu)榘咨?，菌落表面褶皺明顯且布滿短細(xì)白毛。菌絲比常見的絲狀真菌短粗且有隔，可觀察到孢子。利用真菌基因組的ITS保守序列進(jìn)行菌種鑒定，PCR擴(kuò)增序列經(jīng)測(cè)序后在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示該菌與青霉屬青霉亞屬的刺糙青霉(Penicilliu

5、m echinulatum)親緣關(guān)系最近。產(chǎn)物鑒定發(fā)現(xiàn)與美伐他汀參考品有幾乎完全相似的Rf值(TLC)、峰形圖(uv)、保留時(shí)間(HPLC)和譜學(xué)特征(MS)，證明IMBM21的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物為美伐他汀。 短鏈脂肪酸是聚酮體合成的生源，在美伐他汀生物合成時(shí)直接起作用的前體物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)研究了乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉三類物質(zhì)，結(jié)果表明丙酸鈉在132h添加量為0.010％時(shí)，能提高IMBM21菌株生物合成美伐他汀的比生產(chǎn)率79.85％。

6、 豆油作為長鏈脂肪酸的代表，添入到培養(yǎng)基之后，菌體先將其分解為甘油和不同長度的脂肪酸，進(jìn)入美伐他汀的生物合成。脂肪酸作為合成前體，對(duì)美伐他汀的生物合成有明顯的影響，甘油的添加沒有顯著影響美伐他汀的產(chǎn)量，但對(duì)菌體生物量有明顯的影響。所以豆油添加實(shí)驗(yàn)表明，在120h添加0.30％的豆油的條件下，可以使比生產(chǎn)率較對(duì)照提高33.35％，豆油代謝后主要起作用的物質(zhì)是脂肪酸。 TCA循環(huán)是微生物生命活動(dòng)中物質(zhì)和能量代謝的主要途徑，添

7、加TCA循環(huán)的中間體，可以影響碳代謝和能量代謝，從而影響美伐他汀生物合成中碳單位來源。實(shí)驗(yàn)研究了檸檬酸、檸檬酸三鈉、檸檬酸鐵、丙酮酸和琥珀酸添加后對(duì)美伐他汀生物合成的影響，表明檸檬酸三鈉在72h時(shí)添加0.05％可以顯著地提高比生產(chǎn)率達(dá)83.83％。 分別在兩個(gè)濃度下添加常見的9種氨基酸，包括天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、賴氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、蘇氨酸

8、(Thr)和纈氨酸(Val)，通過美伐他汀生物合成中的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行比較，表明生物合成過程中pH值有明顯的提高，使整個(gè)菌體生長環(huán)境改變?yōu)槿鯄A性，Asp、Lys、Leu、Met和Phe能提高菌體生物量，Lys、Leu在0.10％濃度時(shí)開始抑制菌體生長。Asp、Glu、Ile、Met、Thr和Val都能提高美伐他汀生物合成的量，除Met之外，都隨添加濃度的增加而呈現(xiàn)產(chǎn)量提升的趨勢(shì)。 以上結(jié)果表明，基于代謝途徑選擇的前體，在美伐他汀生物