二苯乙烯苷通過抑制ROS相關(guān)的線粒體和JNK,P38通路對(duì)MPTP誘導(dǎo)的帕金森病小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用.pdf

1、帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是一種以靜止性震顫,肌僵直,動(dòng)作遲緩和姿勢(shì)反射障礙為主要臨床表現(xiàn)的中老年人群中常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其病理特點(diǎn)是中腦黒質(zhì)致密部(substantianigraparscompact,SNpc)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元變性缺失。目前的藥物治療并不能阻止或延緩PD的進(jìn)程,僅能緩解癥狀,且長期治療會(huì)出現(xiàn)療效遞減,產(chǎn)生很多副作用。研究表明,PD發(fā)病的重要因素有可能是氧

2、化應(yīng)激或者線粒體功能障礙。還有研究表明MAPK通路在PD的發(fā)病中起重要作用。阻斷JNK和P38的激活可以抑制MPTP導(dǎo)致的神經(jīng)毒性。
　　1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyrid-ine,MPTP)是經(jīng)典的PD造模藥物之一。其代謝產(chǎn)物1-甲基-4苯基吡啶離子(1-methy-4-phenylpyridinium,MPP+)是誘發(fā)神經(jīng)毒性的主要物質(zhì)

3、。在DA能神經(jīng)元內(nèi),MPP+可以通過抑制線粒體復(fù)合物I破壞電子呼吸鏈,從而產(chǎn)生大量ROS,進(jìn)一步導(dǎo)致黑質(zhì)DA能神經(jīng)元缺失。
　　何首烏的根是一種傳統(tǒng)的中草藥,具有抗衰老的作用。二苯乙烯苷(2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)是其主要活性成分之一。具有很多生物學(xué)特性,例如:抗氧化、抗炎、抗動(dòng)脈硬化等作用。研究發(fā)現(xiàn)TSG不僅可以通過抑制ROS保護(hù)腦組織,并且可以阻斷J

4、NK激活保護(hù)大腦不受缺血的損傷,TSG可以降低α突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)的過度表達(dá)(APP轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠模型)。還可抑制MPP+對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)毒性作用。
　　我們課題組近期的實(shí)驗(yàn)表明,TSG可以通過阻斷ROS-NO相關(guān)的JNK通路抑制MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步研究TSG在體內(nèi)的神經(jīng)保護(hù)作用,本次實(shí)驗(yàn)的目的如下:1)利用PD小鼠模型,驗(yàn)證TSG的神經(jīng)保護(hù)作用;2)測定這種神

5、經(jīng)保護(hù)作用是否與ROS介導(dǎo)的JNK,P38以及線粒體通路有關(guān)。
　　【目的】：
　　1.建立MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型。
　　2.觀察TSG對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠行為學(xué)、形態(tài)學(xué)及生化方面的影響。
　　3.探討TSG是否通過調(diào)節(jié)ROS介導(dǎo)的JNK,P38和線粒體通路,發(fā)揮對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　【方法】：
　　1.動(dòng)物分組與造模:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為7組,每組10只。A組:正常組,

6、連續(xù)7d腹腔注射(i.p.)生理鹽水0.1ml/次,1h后給予等量的生理鹽水灌胃(i.g.),1次/d,隨后的7d,給予生理鹽水(i.g.),1次/d;B組:MPTP模型組,連續(xù)7d(i.p.)MPTP(生理鹽水溶)30mg/kg,1h后給予等量的生理鹽水(i.g.),1次/d,隨后的7d,給予生理鹽水(i.g.),1次/d;C、D組為TSG治療組,給予MPTP(i.p.)30mg/kg,1h后分別給予TSG(純度98％)(i.g.)2

7、0mg/kg或40mg/kg,1次/d,連續(xù)7d,隨后的7d停止MPTP注射,只給予TSG(i.g.)20mg/kg或40mg/kg;E、F組,連續(xù)7d給予生理鹽水(i.p.)0.1ml/次,1h后分別給予TSG(i.g.)20mg/kg或40mg/kg,1次/d,隨后的7d只給予TSG(i.g.)20mg/kg或40mg/kg;G組,NAC阻斷劑組,給予MPTP(i.p.)30mg/kg,1h后給予NAC(i.g.)200μM/kg,

8、1次/d,連續(xù)7d,隨后7d停止注射MPTP,只給予NAC200μM/kg(i.g.)。完成給藥后1天,利用爬桿和曠場實(shí)驗(yàn),衡量行為學(xué)變化。
　　2.完成行為學(xué)檢測后,灌注小鼠,迅速取腦,并制作冰凍切片,用免疫熒光染色法檢測酪氨酸羥化酶(TH)陽性神經(jīng)元數(shù)目的變化。
　　3.全波段自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測ROS水平。
　　4.高效液相色譜法檢測紋狀體中DA、二羥基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的含量。
　　5.W

9、esternBlot檢測JNK,p-JNK,P38,p-P38,ERK,p-ERK,bcl-2,bax,cytc,smac,cleaved-caspase-3,cleaved-caspase-6,cleaved-caspase-9蛋白的表達(dá)。
　　【結(jié)果】：
　　1.行為學(xué)結(jié)果顯示:在爬桿實(shí)驗(yàn)中,給予小鼠MPTP后,與空白對(duì)照組比較,爬桿時(shí)間(TLa)顯著升高(P<0.01)。但在給予TSG治療后,與模型組相比,TLa明顯縮

10、短,而40mg/kgTSG組改善的更為明顯(P<0.01)。單純給予TSG組與空白對(duì)照組相比,并沒有顯著差異(P>0.05)。給予NAC后,TLa與模型組相比也有明顯的改善(Fig.2a,P<0.01)。礦場試驗(yàn)中,與空白對(duì)照組比較小鼠的運(yùn)動(dòng)速度(V)在給予MPTP后顯著降低(P<0.01),在中央停留時(shí)間(T)明顯延長(Fig.2b,P<0.01),然而經(jīng)過TSG治療后,V恢復(fù)到4.367cm/s,T下降到11.00s,單獨(dú)給予TSG

11、組與空白對(duì)照組無明顯差異(P>0.05),在給予NAC治療后,與MPTP組相比,V明顯增加,T明顯降低(Fig.2c,P<0.05)。icloud
　　2.免疫熒光染色結(jié)果顯示:黑質(zhì)內(nèi)TH陽性神經(jīng)元的計(jì)數(shù)采用雙盲法。在熒光顯微鏡下可觀察到與空白對(duì)照組相比模型組TH陽性神經(jīng)元減少幅度約為66.9%(P<0.01),然而TSG處理后,TH陽性神經(jīng)元呈劑量依賴性恢復(fù)。而單純給予TSG組的TH陽性神經(jīng)元與正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.0

12、5)。與高劑量組類似,給予NAC治療后,TH陽性神經(jīng)元顯著升高(Fig.3,P<0.05)。
　　3.高效液相結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,MPTP處理后紋狀體內(nèi)DA水平下降了82%,DOPAC,HVA水平也相應(yīng)下降到正常組的15%和19%,但給予TSG治療后,DA,DOPAC,HVA水平逐漸升高,呈劑量依賴性。單獨(dú)給予TSG的小鼠紋狀體內(nèi)DA,DOPAC,HVA水平與正常組相比并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。而NAC治療后,DA

13、,DOPAC,HVA水平也顯著恢復(fù)(Fig.4,P<0.05)。
　　4.全波段自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀檢測ROS結(jié)果顯示,在MPTP處理組中,ROS水平與空白對(duì)照組相比,有了明顯的升高(P<0.01)。不同劑量的TSG(20和40mg/kg)或NAC治療后,與模型組相比,ROS水平明顯下降(P<0.01),且TSG呈劑量依賴性。單獨(dú)給予TSG后,與正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這說明TSG的保護(hù)作用與NAC相似(Fig.5)。<

14、br>　　5.WesternBlot方法檢測結(jié)果表明,與MPTP組相比,TSG(20和40mg/kg)干預(yù)組可以顯著改善JNK,P38以及線粒體通路的激活,但對(duì)ERK通路并無影響。給予NAC治療的小鼠與TSG的效果類似,也抑制了JNK,P38以及線粒體通路的激活。
　　【結(jié)論】：
　　1.TSG對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　2.TSG可能通過抑制ROS介導(dǎo)的JNK,P38和線粒體通路發(fā)揮對(duì)MPTP誘導(dǎo)