二苯乙烯苷對糖尿病胃腸動力紊亂的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、二苯乙烯苷對糖尿病胃腸動力紊亂的保護(hù)作用及其機(jī)制
　　第一部分二苯乙烯對糖尿病小鼠胃腸動力紊亂的作用及其機(jī)制
　　胃腸動力紊亂是糖尿病長期并發(fā)癥之一,其嚴(yán)重影響著病人的生活質(zhì)量和血糖控制,促使病情惡化。胃腸動力紊亂的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激、糖基化終末產(chǎn)物、凋亡及神經(jīng)損傷等多種因素有關(guān),尤其是氧化應(yīng)激扮演重要角色。從中藥何首烏提取的活性單體二苯乙烯苷(2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D

2、-glucoside,THSG)有著較強(qiáng)的抗氧化作用。因此,推測THSG對糖尿病胃腸動力紊亂有著一定的預(yù)防保護(hù)作用。
　　目的:研究THSG對糖尿病小鼠胃排空和小腸推進(jìn)的影響及其作用機(jī)制。
　　方法:采用一次大劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)小鼠糖尿病(diabetes mellitus,DM)模型,血糖濃度高于16.7mmol/L被認(rèn)為造模成功,入圍下一步實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為正常組、DM組和TH

3、SG治療組(10,30,60mg·kg-1,1次/日),連續(xù)灌胃8周,觀察各組血糖、體重、進(jìn)食和飲水量情況;采用亞甲藍(lán)法檢測小鼠胃排空率及小腸推進(jìn)指數(shù);采用生物化學(xué)法分別檢測回腸組織中丙二醛(MDA)含量,谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和總超氧化物歧化酶(SOD)的活力;采用TUNEL法原位檢測回腸組織細(xì)胞凋亡程度;采用免疫印染技術(shù)(western-blotting)檢測回腸組織cleaved caspase-3、ERK1/2、PP

4、AR-γ和SIRT1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:①THSG治療8周對STZ誘導(dǎo)的DM小鼠血糖水平、進(jìn)食及飲水量增加無顯著影響,但其能部分緩解DM小鼠體重的減輕。②與正常小鼠胃排空率(73.76±2.99％)比,DM小鼠明顯降低至26.03±2.99％,出現(xiàn)胃排空延遲。THSG(10,30,60mg·kg-1)可逆轉(zhuǎn)DM小鼠胃排空率的降低,分別增至70.11±4.14,70.79±3.21,72.80±2.25％。③DM小鼠小腸推進(jìn)指數(shù)

5、與正常小鼠(43.20±1.02％)比顯著增加至68.71±1.61％,出現(xiàn)腸推進(jìn)加快。THSG(10,30,60mg·kg-1)能劑量依賴性地改善DM小鼠小腸推進(jìn)指數(shù)的增加,使之分別降至54.92±2.08,46.09±3.23,45.35±2.33％。④與正常組比(1.14±0.04nmol·mgprot-1),DM組小鼠回腸組織MDA含量明顯升高(3.86±0.20nmol·mgprot-1);THSG(10,30,60mg·kg

6、-1)可劑量依賴性地降低DM小鼠MDA含量的升高。⑤與正常組(485.10±14.24U·mgprot-1)相比,DM小鼠回腸組織GSH-PX活力顯著降低(223.17±8.70U·mgprot-1);THSG(10,30,60mg·kg-1)可劑量依賴性地改善這種GSH-PX活力的降低,分別增至359.98±25.37,454.87±19.61,848.70±56.85U·mgprot-1。⑥與正常組(60.61±1.63U·mgpr

7、ot-1)比,THSG(10,30,60mg·kg-1)可劑量依賴性地增加SOD活力,分別為86.52±4.93,87.51±3.52,109.44±9.34U·mgprot-1,但始終低于糖尿病組(132.20±6.39U·mgprot-1)。⑦TUNEL結(jié)果顯示,DM組小鼠回腸組織凋亡程度較正常組明顯增加;THSG(60mg·kg-1)明顯減輕DM小鼠凋亡細(xì)胞的程度和數(shù)量。⑧THSG(60mg·kg-1)顯著抑制DM小鼠回腸組織促凋

8、亡蛋白cleaved caspase-3表達(dá)的增多。⑨與正常組比,DM小鼠回腸組織ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯降低;THSG(60mg·kg-1)能顯著提高DM小鼠ERK1/2蛋白磷酸化水平。⑩與正常組相比,DM小鼠回腸組織PPAR-γ和SIRT1蛋白表達(dá)明顯降低;給予 THSG(60mg·kg-1)能顯著提高它們在DM小鼠的表達(dá)。
　　結(jié)論:SIRT1和PPAR-γ蛋白表達(dá)降低以及ERK1/2相關(guān)的MAPK信號通路激活減少可能

9、是糖尿病胃腸動力紊亂的發(fā)病機(jī)制之一。THSG通過上調(diào)DM小鼠回腸組織PPAR-γ和SIRT1蛋白表達(dá),抑制促凋亡蛋白cleaved caspase-3表達(dá)及激活ERK1/2信號通路,發(fā)揮對STZ誘導(dǎo)的DM小鼠胃腸動力紊亂的保護(hù)作用。
　　第二部分二苯乙烯苷對糖尿病小鼠腸道氮能神經(jīng)的影響
　　糖尿病氮能神經(jīng)(nitregic neurons)受損是導(dǎo)致胃腸動力功能異常的直接原因。前述結(jié)果已證實(shí)THSG可改善DM小鼠胃排空延遲和

10、腸推進(jìn)加快,提示其改善作用可能與神經(jīng)保護(hù)有關(guān)。另外,本課題組已證實(shí)THSG能增加eNOS功能,緩解炎性腸病誘發(fā)的iNOS增加,而其對 nNOS(神經(jīng)型一氧化氮合酶,氮能神經(jīng))的影響未報(bào)道。目的:觀察THSG對DM小鼠nNOS表達(dá)的作用及其對一氧化氮(nitric oxide,NO)介導(dǎo)的非膽堿能非腎上腺素能(NANC,nonadrenergic,noncholinergic)舒張的影響。
　　方法:采用一次大劑量腹腔注射STZ誘導(dǎo)

11、小鼠DM模型。實(shí)驗(yàn)分為正常組,DM組和THSG治療組(60mg·kg-1,一日/次,連續(xù)灌胃治療8周)。采用免疫組織化學(xué)法檢測nNOS在回腸組織的表達(dá);通過多道生理記錄儀記錄由電場刺激(電壓40V,頻率10Hz,波寬5ms,持續(xù)10s)誘導(dǎo)的小鼠離體近端結(jié)腸NANC舒張活動,分別觀察不同濃度THSG(0.1,1,3,10,100μM)及THSG長期預(yù)防性治療(連續(xù)灌胃8周)對小鼠離體近端結(jié)腸NANC舒張的影響。
　　結(jié)果:①免疫組

12、織化學(xué)結(jié)果顯示,與正常組比,DM組回腸組織nNOS表達(dá)明顯減少;THSG治療組nNOS表達(dá)較DM組顯著增加。②結(jié)腸肌張力實(shí)驗(yàn)顯示,THSG(0.1,1,3,10,100μM)對正常小鼠無明顯作用,同樣濃度下,它卻可劑量依賴性地顯著增加DM小鼠離體近端結(jié)腸NANC舒張率(％),從模型組的14.81±1.02％依次增至15.21±2.77,22.54±2.32,33.74±2.41,42.07±4.19,46.13±3.45％。與正常組比(